Quantitative Proteomanalyse der Bindeproteine von Histon H3 und dem Four-and-a -Half-LIM 3 (FHL3) Protein

Abstract

Die Aufklärung spezifischer Protein-Protein-Interaktionen ist eine Grundvoraussetzung für das Verständnis vieler zellulärer Vorgänge. Durch massenspektrometrische Proteomanalysen wurde eine Vielzahl von posttranslationalen Proteinmodifikation, wie beispielsweise Phosphorylierungen, entdeckt, die Protein-Protein-Interaktionen regulieren können. Diese regulatorischen Proteinmodifikationen erschweren die Analyse der Protein-Protein-Interaktionen weiterhin, da sie in manchen Fällen Interaktionen erst ermöglichen, in anderen Fällen diese jedoch unterdrücken. Ziel dieser Arbeit war es, mit den Mitteln der Chemischen Biologie und massenspektrometrischer Proteomanalysen die Protein-Protein-Wechselwirkungen von Histon H3 in Abhängigkeit von Phosphorylierung zu untersuchen sowie die Bindungspartner des Adapterproteins Four-and-a-Half-LIM 3 (FHL3) zu identifizieren. Das erste Projekt dieser Arbeit widmete sich den phosphorylierungs-abhängigen Interaktionsproteinen von Histon H3. Histone verpacken DNA in Form von Chromatin und können Genregulation über posttranslationale Modifikationen steuern. Die Phosphorylierung von Serin-10 in Histon H3 ist eine dieser Modifikationen. In diesem Projekt sollten Proteine identifiziert werden, die vermittelt durch diese Modifikation an Histon H3 binden. Des Weiteren war geplant Bindeprotein von H3 zu identifizieren, die durch die Serin-10-Phosphorylierung von Histone H3 unterdrückt werden sowie die zugehörigen Phosphatasen, die diese Modifikation entfernen. Dazu wurde Phosphonomethylenalanin (Pma), ein Mimetikum von Phosphoserin, dass nicht durch Phosphatasen gespalten werden kann, an Position 10 in ein Peptid inkorporiert, das vom N-Terminus von H3 abgeleitet wurde. Nach Funktionsüberprüfung dieses Pma-modifizierten Peptids wurde eine Proteomanalyse basierend auf der SILAC-Methode (Stable isotope labeling by amino acids in cell culture) durchgeführt. Durch diese Analyse wurden diverse 14-3-3-Isoformen als Bindeproteine von Serin-10-phosphorylierten Histon H3 identifiziert. Phosphatasen konnten hingegen nicht gefunden werden. Differenzielle SILAC–Analysen mit H3-Peptiden synthetisiert aus L- oder D-Aminosäuren erlaubten weiterhin die Identifikation vieler Proteine, die spezifisch an unmodifiziertes H3 binden. Darunter waren Komponenten eines Deacetylase-Komplexes (NuRD), Hitzeschockproteine (HSC70, APG2), transkriptionellen Aktivatoren (WDR5, MYST2) und Repressoren (EHMT2, KDM5B). Mit HAT1 und RBBP7 wurden ferner zwei Bindeproteine vom unmodifizierten H3 identifiziert, deren Bindung durch die Phosphorylierung von Serin-10 unterdrückt wurde. In nachfolgenden Validierungsexperimenten konnten diese Beobachtungen bestätigt werden. Für ausgewählte Proteine wurde des Weiteren die Beeinflussung des Bindungsvermögens in Abhängigkeit von allen bekannten Phosphorylierungen in H3-Tail untersucht. In einem zweiten Projekt wurde das Four-and-a-Half-LIM 3 (FHL3) Protein einer quantitativen SILAC-Proteomanalyse unterzogen, mit dem Ziel, die bislang noch größtenteils unbekannten Interaktionspartner dieses Adapterproteins zu identifizieren und eine vermutete Interaktion mit Chromatinkomponenten experimentell zu überprüfen. Zunächst konnte gezeigt werden, dass FHL3 sowohl im Zellkern als auch im Cytosol, der für die Proteomanalyse verwendeten Fibroblastenzelline (Swiss 3T3) lokalisiert ist. Die nachfolgenden Proteomanalysen erlaubten die reproduzierbare Identifikation von 484 FHL3-Bindeproteinen in Zellkernextrakten und 244 in den cytosolischen Fraktionen dieser Zelllinie, wobei die meisten der identifizierten Protein bis jetzt nicht als Interaktionspartner von FHL3 beschrieben wurden. Eine direkte Interaktion mit Histonen konnte nicht beobachtet werden, wohl aber Proteine, die an Chromatinprozessierungen beteiligt sind. Ausgewählte FHL3-Interaktionspartner wurden durch Pull-Down Experimente und Western Blot Analyse bestätigt. Darunter befanden sich der transkriptionelle Coaktivator CBP, Schlüsselkomponenten der eukaryotischen DNA-Replikation (MCM3 und POLD1) und die mitotische Serin/Threonin-Kinase TLK1. Neben diesen kernlokalisierten Proteinen konnte die FHL3-Interaktion der Ubiquitin-Ligase DTX3L im nuklearen Extrakt und der cytosolischen Fraktion bestätigt werden sowie die FHL3-Bindung der cytosolischen Polyphosphoinositide-Phosphatase FIG4. Durch diese Proteomanalyse und die nachgeschalteten Validierungsexperimente konnte FHL3 mit einer Vielzahl essentieller sowie pathologischer zellulärer Prozesse in Verbindung gebracht werden.

The identification of specific protein-protein interactions is a basic requirement for a comprehensive understanding of many cellular processes. Mass spectrometric proteome analyses have uncovered a multitude of posttranslational protein modifications, such as protein phosphorylation, which regulate protein-protein interactions. These regulatory modifications add a new layer of complexity because they can either facilitate or block protein-protein interactions. The aim of this thesis was the investigation of protein-protein interaction network of histone H3 and its modulation by protein phosphorylation as well as the identification of binding partners of the adapter protein Four-and-a-Half-Lim 3 (FHL3) by means of chemical biology and mass spectrometric proteomic analysis. The first project of this thesis focused on the phosphorylation-depended interaction proteins of histone H3. Histones package DNA in form of chromatin and control gene activity via posttranslational modifications. The phosphorylation of serine-10 is one of those modifications and in this project proteins should be identified that bind to histone H3 in response to this modification. Furthermore, it was planned to identify binding proteins of unmodified H3, which are suppressed by serine-10 phosphorylation and to find associated phosphatases which remove this modification. Therefore, phosphonomethylenalanin (Pma), a mimetic of phosphoserine that cannot be cleaved by phosphatases was incorporated at position 10 in a peptide derived from the N-terminus of H3. After testing the functionality of the Pma-modified peptide, a proteome analysis was performed based on the SILAC method (stable isotope labeling by amino acids in cell culture). The analysis uncovered various 14 3 3 isoforms as binding proteins of serin-10 phosphorylated histone H3. However, phosphatases could not be identified. Differential SILAC analyses with H3 peptides synthesized from L or D amino acids identified many proteins that specifically bind to unmodified H3. Among them are components of a deacetylase complex (NuRD), heat shock proteins (HSC70, APG2), transcriptional activators (WDR5, MYST2) and repressors (EHMT2, KDM5B). Furthermore with HAT1 and RBBP7 two binding proteins of the unmodified H3 were identified, whose binding activity was suppressed by the phosphorylation of serine-10. These observations were confirmed in subsequent validation experiments. In addition the modulation of binding capability of selected proteins was examined in dependency of all known phosphorylation sites in H3. In the second project the Four-and-a-Half- LIM protein 3 was subjected to a quantitative proteome analysis with the aim to identify the interaction partners of this adapter protein and to verify a putative interaction with chromatin components. Initially, it has been demonstrated that FHL3 is localized in both the nucleus and the cytosol of Swiss 3T3 mouse fibroblasts used in this project. The following 484 FHL3 binding proteins were identified in nuclear extracts and 244 in the cytosolic fractions of this cell line. Most of these reproducibly identified proteins have not been described as interaction partner of FHL3. A direct interaction with histones could not be observed but several proteins involved in chromatin processing could be identified. Selected FHL3 interaction partners were confirmed by pull-down experiments and western blot analysis. These proteins include the transcriptional coactivator CBP, key components of the eukaryotic DNA replication (MCM3 and POLD1) and the mitotic serine/threonine kinase TLK1. Beside these nuclear localized proteins, an interaction between FHL3 and the ubiquitin ligase DTX3L could be confirmed in the nuclear and the cytosolic fraction of Swiss 3T3 cells as well as the interaction of FHL3 with the cytosolic polyphosphoinositide phosphatase FIG4. Based on this proteome analysis and the downstream validation experiments FHL3 could be connected to a variety of essential, as well as pathological cellular processes.