Proteolytische Aktivität von APC bei der Inaktivierung verschiedener Faktor VIII-Präparate und bei der Faktor VIIIa-Inaktivierung in Gegenwart eines APC- DNA-Aptamers

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde im ersten Abschnitt überprüft, ob Unterschiede in der proteolytischen Aktivität von APC bei der Inaktivierung von fünf aktivierten humanen pb- und fünf rFVIII-Präparaten sowie Unterschiede in den APC-Sensitivitäten dieser FVIIIPräparate zu ermitteln sind. Zu Beginn der Untersuchungsreihe wurden die eingesetzten FVIII-Präparate funktionell analysiert. Hierzu wurde untersucht, ob Unterschiede in der vergleichenden Aktivitätsbestimmung durch verschiedene Messmethoden und in der Thrombin- vermittelteten Aktivierung der zehn humanen FVIII-Präparate zu ermitteln sind. Die vergleichende Aktivitätsbestimmung der FVIII-Präparate mit zwei verschiedenen aPTT-basierten koagulometrischen Messungen und einem chromogenem Peptid-Substrat-Assay zeigte deutliche Ergebnisdiskrepanzen innerhalb der verschiedenen Messmethoden. In den Gerinnungszeitmessungen wurden dabei höhere FVIII-Bestimmungswerte gemessen. Außerdem wurde festgestellt, daß pbFVIII- Präparate signifikant höhere Aktivitäten in allen drei Bestimmungen aufwiesen. Die erzielten Resultate repräsentieren die bestehende schwierige Situation, den Gehalt an FVIII in Gerinnungskonzentraten oder Plasmaproben exakt zu bestimmen. Neben Aspekten zur Testdurchführung wurden als vorrangige Ursachen für die in dieser Arbeit erreichten Versuchsergebnisse mögliche Einflüsse der FVIII-Molekülstruktur, Herstellungsverfahren und Inhaltsstoffe, wie Von- Willebrand-Faktor und aktiviertem FVIII (FVIIIa), vermutet. Ermittelt wurden deutliche Unterschiede zwischen der Gruppe der plasmabasierten und der Gruppe der rekombinanten FVIII-Präparate bei der Aktivierbarkeit durch Thrombin. Aus Plasma gewonnene FVIII-Konzentrate erreichten eine statistisch signifikant höhere Thrombin-induzierte Aktivitätsbildung. Die Gruppe der rekombinanten FVIII-Konzentrate bildeten in den Aktivierungsversuchen ihre maximalen Aktivitäten durch eine geringere Menge an Thrombin aus als plasmabasierte FVIII-Konzentrate, was auf eine höhere Thrombin-Sensivität der rFVIII- Präparate hinweist. Faktor VIII-Aktivierungsexperimente mit reduzierter pbFVIII-Menge sowie erhöhter rFVIII-Menge ließen nicht ausschließen, dass aus Plasma gewonnene FVIII-Präparate Inhaltsstoffe aufweisen, die die Aktivität von Thrombin hemmen. Der aufgebaute Thrombin- Neutralisationstest zum Nachweis von möglichen Thrombin-Inaktivatoren zeigte keine Hinweise dafür, dass plasmabasierte FVIII-Konzentrate thrombin-inhibierende Einheiten beinhalten, die einen Einfluss auf die Aktivität von Thrombin ausüben. Aufgrund der erzielten Ergebnisse wurde dem etablierten Assay die Fähigkeit zugewiesen, einen Thrombin- Inaktivator nachzuweisen, der mindestens über ein fünfzehntel der Stoffmengenkonzentration von Thrombin verfügt. Die ermittelten FVIIIa- Restaktivitäten, die nach der Inkubation mit APC vorlagen und die jeweiligen IC50-Werte wurden zum Vergleich der proteolytischen Inaktivierung der FVIII Präparate durch APC und zur Analyse der APC-Sensitivität der einzelnen Präparate herangezogen. Unterschiede bei der proteolytischen APC-Aktivität bezüglich der Spaltung von FVIIIa verschiedener FVIII-Präparate wurde nicht festgestellt. Die IC50-Werte lagen in einem Bereich von 0,81 und 1,99 nM. Das Versuchsergebnis weist darauf hin, dass plasmabasierte und rFVIII-Präparate vergleichbare APC-Senstivitäten besitzen. Ziel des zweiten Abschnitts der Dissertation war, den Einfluss der von der Arbeitsgruppe hergestellten APC- Aptamere HS02 auf die proteolytische Aktivität von APC in Hinblick auf die APC-induzierte FVIIIa-Inaktivierung zu prüfen. Es konnte gezeigt werden, dass das in seiner Originalsequenz 88 Nukleotide umfassende Aptamer HSO2-88 die antikoagulatorische Aktivität von APC fast vollständig inhibiert. Bei einem 100-fachen molaren Aptamer-Überschuss von HS02-88 im Verhältnis zum eingesetzten APC konnte die Reduzierung der FVIIIa-Aktivität auf 10 % limitiert werden. Hinweise dafür, dass durch die Aptamere die Mitglieder des intrinsischen Tenase-Komplexes in ihrer Aktivität beeinflusst werden, konnten anhand von APC-freien Kontrollen nicht gefunden werden. Anhand der ermittelten IC50-Werte wurde als Minimalmotiv die Aptamer-Variante HS02-44G identifiziert. Durch Einsatz der Aptamere HS02-88 und HS02-44G konnte eine signifikante Verlängerung der FVIIIa-Halbwertszeit im untersuchten Zeitraum von 30 Minuten erreicht werden. Aus den Versuchsergebnissen wurde gefolgert, dass essentielle Sekundärstrukturelemente für die Bindung des Aptamers an APC eine aus minimal 44 Nukleotiden gebildete Stem-Loop- Struktur mit der enthaltenen Konsensussequenz aus 14 Nukleotiden sowie ein CTBasenüberhang sind. Die Daten legen nahe, dass die Bindungsstelle des Aptamers im Bereich einer durch basische Aminosäurereste positiv geladenen Oberflächenregion der Proteasen- Domäne des APCMoleküls lokalisiert ist. HS02-Aptamere bieten das Potential, als spezifische Inhibitoren der proteolytischen APCAktivität bei der FVIIIa- Inaktivierung in der Hämophilia A Behandlung zu wirken. In diesem Zusammenhang könnten die Aptamere einsetzbar sein als potentielles Adjuvants, um den Verbrauch an FVIII-Konzentraten in der Substitutionstherapie zu verringern. HS02-Aptamere könnten daneben auch nutzbringend sein als mögliches APC-Antidot und in der Diagnostik zur Bestimmung des APC-Spiegels im Plasma.

In the first part of the present publication was examined, if differences in proteolytic APCactivity on FVIIIa-inactivation of five activated human pb- and five rFVIII-concentrates as well as differences in APC-sensitivities of these FVIII-preparations are detectable. At the beginning of the test series FVIII- preparations were functional analysed. Therefore FVIII-preparations were examined for differences in comparative determination of activity by different methods of measurement and thrombin-mediated activation. Comparing determination of FVIII-activity were measured on the basis of two different aPTT-based coagulation measurements and a chromogenic peptid substrate assay. Results differed considerably depending on the method used with aPTT-based coagulometric assays showing higher FVIII-activities than the chromogenic method. Also it was found out that plasma-derived FVIII-preparations in all of the three measurements possess significant higher activities. These results represent the existing difficult situation to exactly define the amount of FVIII in FVIII concentrates and plasma samples. Besides aspects of test procedure, potential influences of the FVIII-molecule structure, manufacturing processes and ingredients like von Willebrand Factor and activated FVIIIa were also discussed as primary causes for the achieved test-results mentioned in the dissertation. Survey of activatability by Thrombin showed remarkable discrepancies between the group of plasma-derived and the group of recombinant FVIII preparations. Plasma-derived FVIII concentrates were characterised by a statistically significant higher thrombin-induced activity. In the activation- tests the group of recombinant FVIII-Concentrates built their maximum activities by means of a lower amount of thrombin than the plasma-derived FVIII concentrates. This test result was interpreted as expression of a higher thrombin-sensitivity of the recombinant FVIII concentrates. FVIII-activation- experiments with a reduced amount of pbFVIII and a higher amount of rFVIII could not rule out that pbFVIII preparations contain ingredients which inhibit the activity of thrombin. The developed thrombin neutralization test for detection of thromininactivators showed no evidence of thrombin-inhibiting units in plasma-derived FVIIII concentrates which would influence the activity of thrombin. Due to the achieved results the established test was attributed the capability to detect a thrombin inactivator which possesses at least one fifteenth of the concentration of thrombin. Determined FVIII residual activities, which exists after incubation with APC, and respective IC50-values were used in order to compare proteolytic inactivation of the FVIII- peprarations by APC and for analysis APC-sensitivities of each preparation. Differenences in proteolytic APC-activities relative to cleavage of FVIIIa in different FVIIIpreparations was not found. IC50-values were between 0,81 and 1,99 nM. The test results indicate, that plasma-derived and recombinant FVIII- preparations possess comparable APC-sensitivities. Aim of part two of the present study was to analyse the influence of DNA-Aptamers HS02, constructed in the study group, on proteolytic APC-activity with regard to the APC-induced FVIII-inactivation. It was possible to show, that APC-aptamer HS02-88, consisting of 88 nucleotides in ist original sequence, inhibit almost completely the anticoagulant activity of APC. A 100-fold molar aptamer-excess of HS02-88 in relation to the inserted APC was able to limit the reduction of FVIIIa activity to 10 %. APC-free control samples did not indicate that aptamers influence the activity of members of the intrinsic tenase complex. Aptamer variant HS02-44G was identified as the minimal motif on the basis of IC50-values. Aptamers HS02-88 and HS02-44G reached significant prolongation of FVIIIa half-life time in a sample period of 30 minutes. The results of experiments suggest that essential structural elements of the aptamer binding to APC are: a secondary structure that contains a Stem-Loop-Structure, built from a minimum of 44 nucleotides and comprising the 14 nucleotide consensus sequence as well as a CT bulge. It was therefore assumed that the binding site of the aptamer is located to the positively chargedsurface region (anion- binding-exosite) of the APC-protease domain, which consists of acluster of basic residues. HS02-aptamers offer the potential to worked as specific inhibitors of proteolytic APC-activity for FVIIIa-inactivation in hemophilia A treatment. In this context the aptamers could be useful as potential adjuvants to decrease the consumption of FVIII-concentrates in replacement therapy. Besides HS02-aptamers may be used as potential APC-Antidot and in diagnostics for determination of APC levels in plasma.