Ets-1 induzierte Tissue Faktor Promotor Aktivierung durch Auto-Antikörper bei systemischer Sklerose

Abstract

Die systemische Sklerose (SSc) ist eine zu den Kollagenosen gehörende Autoimmun- erkrankung, die mit einer Fibrosierung der Haut und innerer Organe, immunologischen Veränderungen und Vaskulopathie einhergeht. Bekannt ist, dass agonistisch wirkende Autoantikörper (AT1R/ETAR-IgG) gegen den Angiotensin II Typ 1 Rezeptor und den Endothelin-1 Typ A Rezeptor eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie der SSc spielen und mit einem erhöhten Mortalitätsrisiko assoziiert sind. Neben einer gesteigerten Endothelzellproliferation und Fibrosierung begünstigt eine endotheliale Dysfunktion die Entstehung von in situ Thrombosen mit Ausbildung einer obliterativen Vaskulopathie, die vor allem das mikrovaskuläre System betrifft. Dem prothrombotisch wirkenden Tissue Faktor (TF) kommt dabei eine entscheidende Rolle beim Gerinnungsprozess in vivo zu. Ziel dieser Arbeit war es, eine mögliche transkriptionelle Regulation des TF Promotors durch Autoantikörper von SSc-Patienten als neuen Pathomechanismus der thrombotisch obliterativen Vaskulopathie bei der SSc aufzuklären. Methodik Die Experimente erfolgten mit zwei Zelllinien: menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK-293) und immortalisierten humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HMEC-1). Zur Darstellung der transkriptionellen Regulation des TF wurden unterschiedlich große TF Promotorfragmente in einen pGL4.10 [luc] Vektor mit Firefly Luciferase-Gen kloniert und somit rekombinante Plasmide hergestellt. Die Aktivierung des TF Promotors nach Stimulation wurde mittels eines Dual-Luciferase Reporter Assays gemessen. Zur Stimulation wurden neben dem AT1R/ETAR-IgG die natürlichen Liganden Angiotensin II (Ang II) und Endothelin-1 (ET-1) sowie entsprechende spezifische AT1- und ETA -Rezeptorantagonisten zur Bestimmung einer rezeptorabhängigen Aktivierung eingesetzt. Ergebnisse Die Stimulationsexperimente zeigten, dass AT1R/ETAR-IgG und die natürlichen Liganden Ang II und ET-1 zu einer Hochregulation des TF Promotors führen. Diese Aktivierung konnte durch spezifische AT1 - und ETA -Rezeptorblocker inhibiert werden. Darüberhinaus wurde gezeigt, dass der TF eine hochspezifische Bindestelle für den Transkriptionsfaktor Ets-1 aufweist (-448 bis -441 bp), über den AT1R/ETAR-IgG und die natürlichen Liganden Ang II und ET-1 den TF Promotor aktivieren. Schlussfolgerung AT1R/ETAR-IgG trägt AT1R- und ETAR-abhängig über eine Aktivierung des Transkriptionsfaktors Ets-1 und verstärkte TF Expression zur Pathogenese der obliterativen Vaskulopathie bei der SSc bei. Hieraus ergeben sich neue Therapiemöglichkeiten.

Systemic sclerosis (SSc) is a multisystem autoimmune disease, which is characterized by skin fibrosis and fibrosis of internal organs, vascular damage and autoimmunity. Functional autoantibodies (AT1R/ETAR-IgG) against angiotensin II type 1 receptor and endothelin-1 type A receptor play a central role in the pathogenesis of this disease and are associated with a higher risk of mortality. Endothelial dysfunction triggers not only endothelial proliferation and fibrosis but also in situ thrombosis, resulting in obliterative vasculopathy, especially of the microvascular system. Tissue Factor (TF), which initiates the blood coagulation cascade in vivo, plays a key role in creating in situ thrombosis. As an underlying hypothesis, a transcriptional regulation of the TF promoter by AT1R/ETAR-IgG is assumed for the purpose of this research. Methods The experiments were performed with two different cell lines: Human embryonic kidney cells (HEK-293) as well as human microvascular endothelial cells (HMEC-1). To illustrate the transcriptional regulation of the TF, different sizes of TF promotor fragments were cloned in a pGL4.10 [luc] vector with a Firefly Luciferase-Gen and lead to the production of recombinant plasmids. The TF promotor activation was measured by a Dual- Luciferase Reporter Assay, which was proportional to the light emission by Firefly Luciferase. Cells were stimulated with AT1R/ETAR-IgG and natural ligands Angiotensin-II (Ang II) and Endothelin-1 (ET-1) and blocked with specific AT1 and ETA receptor blockers. Results It could be shown that AT1R/ETAR-IgG, isolated from patients with SSc, as well as the natural ligands Ang II and ET-1 lead to an activation of the TF promoter in HMEC-1. This activation could be abolished with specific AT1 and ETA receptor blockers. Furthermore, it could be proven that the TF promotor includes a highly specific binding site for the transcription factor Ets-1 (- 448 to -441 bp) which was induced by AT1R/ETAR-IgG and natural ligands. Conclusion In interaction with AT1R/ETAR-IgG, TF and Ets-1 are involved in the pathogenesis of obliterative vasculopathy by SSc via activation of AT1R and ETAR. This finding has potential to lead towards new therapy method