Optimierung der Kulturbedingungen von T-Zellen zur Anwendung im LDH-Release Assay

Abstract

Das LDH-Release Assay (Lactate-dehydrogenase-Release Assay) ist ein Zytotoxizitätstest, der auf der Freisetzung von LDH aus dem Zytoplasma von Target-Zellen, die durch die zytotoxische T-Zellen (CTLs) lysiert werden, basiert. Dieser Test ist genauer, schneller, einfacher in der Handhabung und kostengünstiger als das Chromium-Release Assay, welches als Standardmethode für die Bestimmung der T-Zellzytotoxizität gilt. Ein Nachteil der LDH-Release- Methode ist aber, dass die LDH sowohl von den Target-Zellen als auch von den CTLs freigesetzt wird. Somit ist die Spezifität der gemessenen Zytotoxizität nicht gesichert. Bei einer hohen Spontanlyse bleiben die Ergebnisse fraglich. Eine hohe Spontanlyse der T-Zellen könnte durch die Verbesserung der Kulturbedingungen dieser Zellen vermieden werden. Aus diesem Grunde sollten die Kulturbedingungen von T-Zellen optimiert werden, um die Aussagekraft dieses Testes zu verbessern. Hierzu wurde in der vorliegenden Arbeit die Auswirkung unterschiedlicher Kulturbedingungen (Interleukin-2 (IL2), Interleukin-7 (IL7), Roswell Park Memorial Institut-Medium (RPMI), Iscove’s modified Dulbecco’s Media (IMDM), fetales bovines Serum (FBS), Human Serum (HS) und β-Mercaptoethanol (Merc)) auf T-Zellen geprüft. Als Quelle für T-Zellen diente das periphere Blut gesunder Spender. Mittels Dichtegradientenzentrifugation wurden T-Zellen isoliert. Nach der Kultivierung der isolierten T-Zellen in den verschiedenen untersuchten Kulturbedingungen, wurden die Vitalität, Zellzahl und Apoptose gemessen. Die besten Kulturbedingungen wurden zur Kultivierung von T-Zellen für die Untersuchung im LDH-Release Assay verwendet. Im LDH-Release-Test wurde auf die Zytotoxizität der kultivierten T-Zellen untersucht. Als Targetzellen wurden REH-Zellen oder frische bzw. kryokonservierte TEL-AML1-negative ALL-Patientenblasten eingesetzt. Als Effektorzellen dienten allogene T-Zellen, die man aus dem peripheren Blut gesunder HLA-gematchter Spender isolierte, oder autologe T-Zellen, die man aus den Blasten selbst in-vitro generierte. Die Vitalität der T-Zellen war signifikant hoch bei IL7-Medien und RPMI-Medien. Dagegen war sie signifikant niedrig bei Mercaptoethanol-Medien. Die Apoptoseraten der T-Zellen waren signifikant niedrig bei IL7-Medien und FBS-Medien. IL2 hatte eine signifikant positive Auswirkung auf die in-vitro Expansion der T-Zellen und eine positive Auswirkung (ohne Signifikanz) auf die Zytotoxizität dieser Zellen. Die Spontanlyse der CTLs in FBS-Medien war signifikant höher als in HS-Medien. Die Zytotoxizitätswerte waren signifikant hoch, wo autologe, nicht kryokonservierte Zellen verwendet wurden. Nach unseren Befunden stellen RPMI, IL2+IL7 und HS die besten Kulturbedingungen von T-Zellen dar. Darüber hinaus sollten im LDH-Freisetzungstest autologe und nicht kryokonservierte Zellen verwendet werden.

The LDH release assay (Lactate dehydrogenase release assay) is a cytotoxicity assay, which is based on the release of LDH from the cytoplasm of target cells, which are lysed by the cytotoxic t-cells (CTLs). This test is more accurate, faster, easier to use and less expensive than the chromium release assay, which is considered to be the standard method for determining the t-cell cytotoxicity. A disadvantage of the LDH-release method is, however, that the LDH is released from both, the target cells and the CTLs. Thus, the specificity of the measured cytotoxicity is not assured. The results remain questionable with a high rate of sponatneous lysis of cells. A high rate of sponatneous lysis of the t-cells could be prevented through the improvement of the culture conditions of these cells. For this reason, the culture conditions of t-cells should be optimized in order to improve the reliability of this test. For this purpose, the effects of different culture conditions (interleukin 2 (IL2), interleukin 7 (IL7), Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI), Iscove's modified Dulbecco's media (IMDM), fetal bovine serum (FBS), human serum (HS) and β-mercaptoethanol) on t-cells were tested in the present study. Peripheral blood of healthy donors was used as a source of t-cells. T-cells were isolated by differential centrifugation. The vitality, cell count and apoptosis of the isolated t-cells were measured after their cultivation in the different tested culture conditions. The best culture conditions were used for the cultivation of t-cells for the study in the LDH release assay. The LDH-release assay was used to test the cytotoxicity of the cultured t-cells. REH cells, fresh or cryopreserved TEL-AML1-negative blasts of ALL-patients were used as target cells. Allogeneic t-cells that were isolated from the peripheral blood of healthy HLA-matched donors or autologous t-cells, which were generated from the blasts themselves in vitro served as effector cells. The viability of the t-cells was significantly high in IL7 media and RPMI media. However, it was significantly low in mercaptoethanol media. The rates of apoptosis of t-cells were significantly low in IL7 media and FBS media. IL2 had a significant positive effect on the expansion of t-cells in vitro and a positive effect (no significance) on the cytotoxicity of these cells. The sponatneous lysis of CTLs in FBS media was significantly higher than in HS media. The results of the measured cytotoxicity were significantly high, where autologous non cryopreserved cells were used. According to our results, RPMI, IL2 + IL7, and HS represent the best culture conditions of t-cells. Furthermore, autologous and non cryopreserved cells should be used for the LDH release assay.