The Role of Sir2's Enzymatic Activity in the Assembly of Silencing Complexes in Budding Yeast

Abstract

The folding of DNA into high-order chromatin structures appears to play a central role in the regulation of gene transcription. During recent years, various complexes associated with transcriptional activation or repression have been shown to contain chromatin remodeling activity or enzymes that covalently modify histones. The inactivation of large domains of DNA by their compaction into an inaccessible chromatin structure is referred to as chromatin silencing. This type of inactivation is involved in regulation of gene expression and is associated with chromosome structures that are involved in epigenetic inheritance. The silent information regulator 2 (Sir2) protein is a key component of the silencing machinery in yeast. Sir2 is an enzyme that couples protein deacetylation to NAD+ hydrolysis and is required for silencing at the silent mating type loci, the telomeres, and the ribosomal DNA repeats in Saccharomyces cerevisiae. In my thesis, I investigated the role of this enzymatic function in the assembly of silencing complexes at different loci. I have examined the assembly of silencing complexes on DNA in cells carrying the sir2-H364Y and sir2-G262A mutations, which both abolish the enzymatic activity of Sir2. I show that the association of the SIR complex (Sir2/Sir4 and Sir3) with DNA at telomeres and the HML-E silencer, as well as the localization of Sir2-GFP, Sir3-GFP, and GFP-Sir4 to subnuclear telomeric foci, are lost in cells containing an enzymatically inactive Sir2 protein. In contrast, Sir2 associates with rDNA and localizes to the nucleolus with approximately equal efficiency in both SIR2 and sir2-H364Y cells. I find further that histone H4 associated with the rDNA repeats is hypoacetylated. Acetylation of H4 in rDNA and telomeric regions is increased in cells containing either a sir2 deletion_or the sir2-H364Y allele, suggesting that Sir2 directly deacetylates histones in these regions. Consistent with this data, I find that mutation of lysine 16 of histone H4 to glutamine, or deletion of histone H3 N-terminal residues 4-30 result in a dramatic loss of rDNA silencing. Finally, I show that the association of Sir3 with rDNA in a sir4D strain requires the enzymatic activity of Sir2, arguing that Sir3 can localize to chromatin independently of interactions with any of the known silencing proteins. Together, these data suggest that the modification of histones or other chromatin proteins by Sir2 creates a binding site for silencing complexes on chromatin.

Die Kompaktierung von DNA in geordnete Strukturen scheint eine zentrale Rolle in der Regualtion der Gentranskription zu spielen. Während der letzten Jahre sind diverse Proteinkomplexe identifiziert worden, die für die Aktivierung oder Inaktivierung der Transkription von Genen verantwortlich sind und die Chromatin-umordnende Aktivität besitzen oder Enzyme enthalten, die Histone kovalent modifizieren. Die Inaktivierung von großen DNA Domänen durch Kompaktierung in eine geschlossene Chromatinstruktur wird als "Chromatin Silencing" bezeichnet. Diese Art der Inaktivierung spielt eine Rolle in der Regulation der Genexpression und ist assoziiert mit Chromosomenstrukturen, die in der epigenetischen Vererbung eine Rolle spielen. Das Silent information regulator (Sir2) Protein ist eine Schlüsselkomponente des Silencing Apparates in Hefe. Sir2 ist ein Enzym, welches die Deacetylierung von Proteinen an die Hydrolyse von NAD+ koppelt und notwendig für Silencing an den "mating type" Loci, den Telomeren und den ribosomalen DNA Einheiten in Saccharomyces cerevisiae ist. In dieser Arbeit habe ich die Rolle der enzymatischen Aktivität bei der Bindung von Silencing-Komplexen an verschiedene Loci untersucht. Im einzelnen habe ich die Bildung von Silencing Komplexen auf DNA in Zellen untersucht, die sir2-H364Y oder sir2-G262A Mutationen tragen, durch welche die enzymatische Aktivität von Sir2 verloren geht. Ich zeige, daß sowohl die Assoziation des SIR Komplexes (Sir2/Sir4 and Sir3) mit DNA der Telomeren und des HML-E silencers, als auch die Lokalisation von Sir2-GFP, Sir3-GFP und GFP-Sir4 zu telomerischen Foci in Zellen, die eine enzymatisch inaktive Variante von Sir2 exprimieren, verloren geht. Im Gegensatz dazu bindet Sir2 mit annähernd gleicher Effizienz sowohl in SIR2 als auch in sir2-H364Y Zellen an rDNA. Außerdem ist sir2-H364Y, genauso wie Sir2, im Nukleolus lokalisiert. Ich konnte weiterhin zeigen, dass an rDNA-Einheiten gebundenes Histon H4 hypoacetyliert ist. Die Acetylierung von Histone H4 in rDNA und Telomeren ist erhöht in Zellen, die entweder kein Sir2 Protein exprimieren oder das sir2-H364Y-Allel tragen. Dies legt nahe, dass Sir2 unmittelbar Histone in diesen Regionen deacetyliert. Im Einklang mit dienen Beobachtungen steht das Ergebnis, dass eine Mutation von Lysin 16 des Histon H4 Proteins zu Glutamin oder die Deletion der Aminosäuren vier bis 30 des N-Terminus von Histone H3 zu einem dramatischen Verlust des rDNA Silencing führt. Schließlich kann ich zeigen, dass Sir3 in einem sir4D Stamm nur dann mit rDNA assoziiert ist, wenn Sir2 enzymatisch aktiv ist. Dies legt nahe, dass Sir3 ohne Interaktion mit einem der bisher bekannten Silencing Proteine an Chromatin binden kann. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Modifikation von Histonen oder anderen Proteinen des Chromatins durch Sir2 eine Bindungsstelle für Silencing-Komplexe in Chromatin eröffnet.