Untersuchung der Knochen bei hepatischer Osteodystrophie am MDR2-/--Mausmodell

Abstract

Osteoporose ist die häufigste Knochenerkrankung in Deutschland und somit ein bedeutendes Thema in der Gesellschaft und vor allem im Gesundheitssystem. Im klinischen Alltag konnte beobachtet werden, dass Patienten, die an einer chronischen Lebererkrankung leiden, meist auch einen gestörten Knochenstoffwechsel aufweisen. Dies wird auch als hepatische Osteodystrophie bezeichnet, wobei die Osteoporose die häufigste Manifestationsform darstellt. Aber welcher Zusammenhang besteht zwischen der Leberschädigung und dem Knochenstoffwechsel? Ziel dieser Arbeit ist es, eine Veränderung am Knochen während der Entwicklung einer Lebeschädigung zu zeigen. Dafür wurde ein Mausmodell verwendet, welches einen Gendefekt im mdr2-Gen aufweist. Dieses Gen ist homolog zu dem menschlichen mdr3-Gen und verschlüsselt das kanalikuläre Membranprotein MDR2. Aufgrund der Mutation bildet sich eine Leberschädigung aus, welche der menschlichen Leberzirrhose entspricht und somit für die Forschung an diesem Krankheitsbild und dessen systemische Einflüsse sehr gut geeignet ist. Für das Versuchsvorhaben wurden Femura von BALB/c Mäusen mit und ohne MDR2-Mutation im Alter zwischen 5 und 44 Wochen hinsichtlich der Knochenstruktur untersucht. Die Mausknochen wurden mittels µCT in zwei definierten Bereichen, dem trabekuläre Netzwerk und der Kortikalis, hinsichtlich folgender Parameter analysiert: BV/TV, BMD, TbN, TbTh, TbSp, ConnD, SMI, sowie für den kortikalen Bereich die Parameter BV/TV, BMD und Barea. Für die histologische Auswertung wurden die zuvor angefertigten 6 µm dünnen Schnitte nach der von-Kossa-Methode gefärbt, und mithilfe eines speziellen Bildanalyseprogramms konnten die Parameter TbDn, TbLeMn, Verzw., BWd, CtWd analysiert und ausgewertet werden. Diese Daten können mit den µCT- Daten verglichen werden, da die ROI der Histologie dem ausgewerteten Bereich des µCT entspricht. Es kann festgestellt werden, dass die Knochen der MDR2-/--Mäuse vor allem in der 20. Woche ein schlechter ausgebildetes trabekuläres Netzwerk im Vergleich zu den Wildtypen aufweisen und somit einer osteoporotischen Knochenstruktur ähneln. Dieses ist anhand der signifikant verminderten Trabekelanzahl und Trabekeldicke zu erkennen, aber auch die Konnektivität ist signifikant vermindert. Diese Ergebnisse des trabekulären Bereiches werden von den histomorphologischen Untersuchungen unterstrichen, die ebenfalls eine signifikante Verminderung der Trabekelanzahl und der Verzweigung zwischen den Trabekeln gegenüber denen der Wildtypen zeigen. Bei der Untersuchung des kortikalen Bereiches konnte gezeigt werden, dass die MDR2-/--Tiere über den gesamten Zeitraum eine geringere Knochenfläche aufweisen, was für einen dünneren Kortex spricht. Dies wird durch den Parameter der Kortexdicke aus der histomorphologischen Untersuchung bestätigt, welcher ebenfalls zu allen Zeitpunkten bei den MDR2-/--Tieren gegenüber den Wildtypen vermindert ist. Die Knochenmineraldichte hingegen ist bei den MDR2-/--Mäusen in der histomorphologischen Untersuchung kurzeitig im Vergleich zu den Wildtypen leicht erhöht, welches sich zu den nachfolgenden Zeitpunkten zugunsten der gesunden Tiere ändert. Dieses konnte allerdings im µCT nicht beobachtet werden. In der vorliegenden Arbeit kann mithilfe des MDR2-/--Mausmodells ein Zusammenhang zwischen der Leberschädigung und dem Knochenstoffwechsel gezeigt werden. Es stellten sich bei den lebererkrankten Tieren eine osteoporoseähnliche Knochenstruktur im trabekulären Bereich sowie ein verdünnter Kortex in der Knochenschaftmitte dar. Zusätzlich konnte durch die Münchner Arbeitsgruppe gezeigt werden, dass die MDR2-/--Mäuse über den gesamten zeitlichen Verlauf die zu erwartende Leberschädigung entwickelten. Aber auch bei der näheren Betrachtung des Zytokin TGF-ß und des Vitamin D-Metabolismus konnte gesehen werden, dass der TGF-ß Spiegel erhöht und die Expression von bestimmten Enzymen im Vitamin D-Metabolismus gemindert ist. Dies sind zwei Faktoren, die sowohl in der Leber als auch in dem Knochen eine wichtige Rolle spielen und somit Gründe für die veränderte Knochenstruktur sein können.

Osteoporosis is the most frequent bone disease in Germany with approximately six million people being affected by it. For this reason osteoporosis is a most relevant topic both for society in general and the health system in particular. In daily clinical practice, it could be observed that patients suffering from chronic liver disease in many cases also suffer from disturbances in bone metabolism. This observation is also referred to as hepatic osteodystrophy, with osteoporosis as its most important clinical manifestation. But what is the relationship between liver damage and bone metabolism? The aim of this dissertation proposal was to demonstrate a change to the bone structure during the development of liver disease. For this purpose, a mouse model was employed that featured a defect in gene MDR2. This gene is homologous to the human MDR3 gene and encodes the canalicular membrane protein MDR2. The mutation leads to liver damage that corresponds to human cirrhosis, and is thus well-suited for research of this disease pattern and its systemic influences. As part of this study, femora of BALB/c mice with and without MDR2 mutation, aged between 5 and 44 weeks, were examined with regard to bone structure. The mouse bones were examined via μCT in two defined areas, i.e. the trabecular network and the cortex, with respect to the following parameters: BV/TV, BMD, TbN, TbTh, TbSp, ConnD, SMI, as well as for the cortical region the parameters BV/TV, BMD und Barea. For histological evaluation, the previously produced 6-µm thin sections were stained according to the von Kossa method, and using a special image analyzing program the parameters TbDn, TbLeMn, trabecular branching, BWd, CtWd could be analyzed and evaluated. These data can be compared to the µCT data, as the ROI of the histology corresponds to the evaluated area of the µCT. It could be observed that the bones of MDR2-/- mice exhibited, especially in the 20th week, a more poorly developed trabecular network as compared to the wild types, thus bearing similarity to an osteoporotic bone structure. This could be seen from the significantly reduced trabecular number and trabecular thickness, but the connectivity was significantly reduced as well. These findings regarding the trabecular region were reflected in the histomorphological examination, which also showed a significant reduction of the trabecular number and the spaces between the trabeculae, as compared to those of the wild types. Examining the cortical region, the MDR2-/- animals were found to have a smaller bone area at all observed time-points, suggesting a thinner cortex. These findings were confirmed by the parameter of cortex thickness in the histomorphological examination, which was also reduced in the case of the MDR2-/-animals at all observed time-points, as compared to the wild types. By contrast, the bone mineral density in the case of the MDR2-/- mice in the histomorphological examination was shortly (in the 15th week) a bit increased in comparison with the wild types, with the results changing in favor of the healthy animals at later points. However, this could not be observed in the µCT. In the present study a relationship between liver damage and bone metabolism could be demonstrated via a MDR2-/- mouse model. Both a bone structure similar to osteoporosis in the trabecular region and a reduced cortex in the middle of the diaphysis could be shown for the animals affected by liver damage. In addition, the Munich-based working group could demonstrate that the MDR2-/- mice were developing the expected liver damage at all observed time-points. But even on closer examination of cytokine TGF-ß and the Vitamin D metabolism, it could be observed that the TGF-ß level was increased and the expression of certain enzymes in the Vitamin D metabolism was reduced. These are two factors that play an important role both in the liver and in the bone and could hence account for the modified bone structure