Funktionelle Echtzeitanalyse der zellulären und molekularen Mechanismen der neuronalen Dysfunktion in chronischer Neuroinflammation

Abstract

Für das Verständnis der Pathomechnismen in der Multiplen Sklerose (MS) ist die Darstellung funktioneller Zusammenhänge maßgeblich, mit bisher angewendeten Methoden jedoch nur bedingt möglich. In dieser Arbeit wurde die Zweiphotonenmikroskopie (TPLSM) auch in Kombination mit Fluoreszenzlebensdauermessung (FLIM) sowohl intravital im Tiermodell als auch in vitro an Patientenzellen genutzt, um die Reaktionen des Gewebes auf die Immunzellinvasion zu untersuchen. Hierbei wurde deutlich, dass das Gewebe des zentralen Nervensystems (ZNS) selbst entscheidende Änderungen in Form von Ausbildung eines retikulären Fasernetzwerkes vollzieht, die es erst ermöglichen, dass massenweise periphere Immunzellen einwandern. Die Immunzellen führen direkt und indirekt zur neuronalen Dysfunktion, welche mittels Messung der intrazellulären neuronalen Calciumkonzentration intravital analysiert wurde. Darüber hinaus konnte erstmals gezeigt werden, dass die Aktivität der NADPH-Oxidase (NOX) als Entstehungsort reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in direkter Korrelation mit der neuronalen Dysfunktion steht. Die Zellen, die für die Produktion der ROS im zentralen Nervensystem verantwortlich sind, waren neben peripheren eingewanderten Makrophagen und ortstständigen Mikroglia auch zu einem großen Teil Astrozyten. Die systemische Komponente der MS spiegelte sich in der Überaktivierung der NOX in peripheren CD11b+-Zellen mit signifikanten Unterschieden zwischen den Erkrankungsstadien bei MS-Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden und Patienten wider. Eine Behandlung mit dem Antioxidans Epigallokatechingallat, einem Extrakt aus grünem Tee, senkte die NOX-Aktivierung auf gesunde Werte. Insgesamt zeigt diese Arbeit neue Zugänge auf, funktionelle Zusammenhänge neuroimmunologischer Erkrankungen im lebendigen Gewebe in Echtzeit zu erforschen.

To fully understand the underlying pathological mechanisms of multiple sclerosis (MS), it is crucial to register and comprehend its functional dynamics. Yet until now, due to the lack of adequate detection methods, many interrelations in cell and metabolism dynamics remain elusive. In this work we introduced two-photon fluorescence microscopy (TPLSM) and its combination with NAD(P)H-fluorescence lifetime imaging (FLIM) both in an animal model for MS as well as human blood cells to investigate tissue and cell response to immune cell invasion. Thereby it became apparent how the central nervous system tissue itself undergoes changes in its extracellular matrix by developing a reticular meshwork that allows peripheral immune cells to infiltrate inflammatory lesions. These immune cells lead to neuronal dysfunction, which was analyzed through measuring intracellular neuronal calcium concentrations in vivo. Furthermore we showed for the first time how the activity of NADPH oxidase (NOX), the main source of reactive oxygen species (ROS), is directly correlated with neuronal dysfunction. The cellular source and the dynamics of ROS production were undetermined up to now, since freely diffusing ROS molecules cannot be localized and their production requires the assembly and not the mere expression of NOX subunits. Using intravital TPLSM and NAD(P)H-FLIM we identified infiltrating peripheral monocytes, activated resident microglia and astrocytes as the main cellular sources of ROS in EAE brainstem lesions. The systemic dimension of MS was mirrored in the over- activation of NOX enzymes in peripheral CD11b+ cells with significant differences between MS patients compared to healthy subjects. Administration of the anti-oxidant epigallocatechin-3-gallate, a green tea extract, counteracted this effect. Overall, this work establishes new intravital approaches to explore functional contexts in neuroinflammation and neurodegeneration in real time.