Fluorometrische Analyse der Assemblierung des Calciumpermeablen Kationenkanals TRPC6

Abstract

In Analogie zu anderen 6-Transmembrandomänen-Kanälen lagern sich TRPC- Untereinheiten zu homo- und heterotetrameren Komplexen zusammen, was bisher mittels biochemischer Methoden sowie durch funktionelle Untersuchungen belegt werden konnte. Diese Protein-Interaktionsnachweise waren häufig mit der Zerstörung der untersuchten Zellen verbunden oder blieben auf die Untersuchung plasmamembranständiger Kanalkomplexe beschränkt, womit dynamische Untersuchungen an lebenden Zellen oder Aussagen über die Kanalassemblierung in subzellulären Kompartimenten nicht möglich waren. In letzter Zeit wird der Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) vermehrt zur Darstellung von Protein-Protein-Interaktion in lebenden Zellen genutzt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden weitere Einsatzmöglichkeiten des FRET zur Untersuchung von Proteininteraktionen dargestellt und auf ihre Validität überprüft. Die räumlich aufgelöste FRET-Darstellung zu verschiedenen Zeitpunkten der Proteinexpression belegt die frühe Zusammenlagerung der TRPC6-Untereinheiten im endoplasmatischen Retikulum und im Golgi-Apparat. Die konfokale FRET-Darstellung bestätigt FRET-Signale über den Endomembranen bei hoher räumlicher Auflösung. Aufgrund der durch fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) belegten Mobilität der TRPC6-Kanäle innerhalb der Plasmamembran erfolgte die konfokale FRET-Darstellung zur Minimierung von Bewegungsartefakten auf Basis eines spektralen Dekonvolutionsverfahrens. Die Quantifizierung der FRET-Effizienz erfolgte unter Berücksichtigung der photophysikalischen Eigenschaften der verwendeten Fluoreszenproteine mittels Akzeptor-Bleichen im Rahmen der digitalen Videomikroskopie. Der hier erbrachte, nicht-destruktive Assemblierungsnachweis ermöglicht die Untersuchung der Dynamik der Kanalassemblierung (z.B. nach Agonisten-Zugabe) auch in subzellulären Kompartimenten. Die schwache Abhängigkeit der FRET- Effizienz vom Expressionsniveau der fluoreszierenden TRPC6-Untereinheiten belegt die Spezifität dieses Protein-Protein-Interaktionsnachweises. Die Wahrscheinlichkeit eines FRET-Signals als Folge lokaler Proteinanhäufungen war angesichts der konfokalmikroskopisch belegten homogenen Membranverteilung und der oben genannten Mobilität der fluoreszierenden TRPC6-Untereinheiten innerhalb der Plasmamembran als sehr gering einzustufen. Der hier vorgestellte kompetitive FRET-Nachweis belegt die Entkopplung von FRET zwischen fluoreszierenden TRPC6-Untereinheiten durch koexprimierte TRPC6-Wildtyp- Untereinheiten nicht jedoch durch TRPC4 beta. Er ist somit nicht nur ein weiterer Spezifitätsnachweis für den FRET, sondern ermöglicht den Interaktionsnachweis zwischen mehr als zwei verschiedenen Proteinen in nur einem Messschritt unter zusätzlicher Berücksichtigung ihrer Affinität zueinander. Dieses Verfahren kann auch die Untersuchung der Dynamik von Affinitäten zwischen unterschiedlichen Untereinheiten eines Proteinkomplexes z.B. nach Agonistenzugabe ermöglichen. Analyse der Stöchiometrie des TRPC6 Die hier vorgestellte Methode der Stöchiometrie-Analyse durch Korrelation von FRET-Effizienz und dem quantitativen Verhältnis Donor- zu Akzeptorfluorochrom- markierter TRPC6-Untereinheiten deutet auf eine tetramere Struktur des TRPC6 und deckt sich mit Ergebnissen aus biochemischen und FRETbasierten Multimerisierungsuntersuchungen der TRP-Familie. Im Gegensatz zu den meisten bisher publizierten Multimerisierungsnachweisen gestattet das hier vorgestellte Verfahren Beurteilungen von Proteinstöchiometrien sowohl in der Plasmamembran als auch in subzellulären Kompartimenten lebender Zellen und schließt die Möglichkeit von Untersuchungen einer Dynamik von Proteinstöchiometrien ein.

By analogy to other cation channel subunits with six transmembrane-spanning domains, the TRPC channels are believed to assemble into homo- or heterotetrameric complexes. These complexes have been verified by biochemical or functional methods related to cell destruction or restricted to surface proteins. Thus dynamic analyses in living cells or analyses of the assembly of channel subunits in subcellular compartiments were not possible. More recently, fluorescence resonance energy transfer (FRET) - a measure for the close proximity of fluorescent molecules - has become instrumental in following protein assembly in living cells. This work demonstrates further possibilities and verification procedures of the FRET-technology to test the assembly of ion channel subunits. Temporally and spatially resolved FRET imaging demonstrates an early assembly of TRPC subunits in the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus. Due to the mobilitly of TRPC6-channels within the plasma membrane proven via fluorescence recovery after photobleaching (FRAP), TRPC-subunit interaction in subcellular compartiments was analysed via confocal FRET imaging based on a spectral deconvolution method. It verifies FRET signals over the plasma membrane at high spatial resolution.The non-destructive proof of subunit assembly presented in this work allows to study the dynamic of protein-interaction even in subcellular compartiments. Quantitative analysis of digital video imaging demonstrates that FRET between TRPC subunits is only weakly concentration-dependent. Thus FRET can be considered as specific proof of interaction between TRPC subunits. Moreover, the introduction of a competition-FRET assay allows to test the ability of wild-type TRPC subunits to recruit fluorescent TRPC subunits into separate channel complexes and offers the possibility to test the interaction between more than two different proteins as well as the affinity between different fluorescent proteins. Finally, correlation between the efficiency of energy transfer and the molar ratio of the FRET donor to the acceptor was exploited to verify the tetrameric stoichiometry of TRPC complexes.