Identifizierung und Evaluierung von GDF15 als resistenzvermittelnder Faktor in der Carboplatintherapie anhand der humanen Ovarialkarzinommodelle A2780 und A2780cis

Abstract

Eierstockkrebs ist die vierthäufigste maligne Erkrankung des gynäkologischen Traktes und die häufigste Todesursache bei Frauen mit gynäkologischen Krebserkrankungen in den westlichen Industrieländern. Dies ist zum einen auf eine zu späte Diagnose und zum anderen auf die Entwicklung von Resistenzen gegenüber der platinbasierenden Standartchemotherapie zurückzuführen. Intention dieser Arbeit war es, potentielle resistenzvermittelnde Faktoren für eine zielgerichtete Therapie im chemotherapieresistenten Ovarialkarzinom zu identifizieren und zu evaluieren. Dazu wurde die humane Ovarialkarzinomzelllinie A2780 und dessen cisplatinresistente Variante A2780cis umfangreich in vitro und in vivo charakterisiert. Basierend auf einer verminderten Proliferationsinhibition, einem verzögerten G2/M-Arrest und einem verstärkten Migrationsverhalten, konnte zunächst eine Kreuzresistenz der A2780cis-Zellen gegenüber der Carboplatintherapie festgestellt werden. Die anschließende Analyse des subkutanen Tumorwachstums in SCID-Mäusen ergab außerdem ein langsameres Tumorwachstum im Basalzustand und eine fehlende Induktion der Apoptose nach der Kurzzeittherapie mit Carboplatin im Vergleich zu den sensitiven Tumoren. Dies war durch einen Verlust des P53- und P21-vermittelten Zellzyklusarrest und einer erhöhten AKT- Überlebenssignaltransduktion gekennzeichnet. Für die Identifizierung resistenzabgeleiteter Faktoren wurde schließlich eine differentielle Genexpressionsanalyse in diesen Tumoren mittels humanen Bead Chip Arrays (HT- 12v3) durchgeführt. Durch Anwendung des linearen Modells konnten die fünf P53-regulierten Gene DRAM1, SULF2, P4HA2, LMNA und GDF15 als potentiell resistenzvermittelnd identifiziert werden. GDF15, ein Mitglied der TGF-β-Superfamilie, wurde als einer der am stärksten durch Carboplatin regulierten Faktoren auf RNA- und Proteinebene evaluiert. In den resistenten Zellen A2780cis wurde eine basal erhöhte RNA- sowie Proteinexpression detektiert, die jedoch unter Therapie nicht weiter anstieg. Diese differentielle GDF15-Regulation spiegelte sich auch im Blutplasma tumortragender Tiere während der Kurz- und Langzeittherapie mit Carboplatin wieder. Eine shRNA-vermittelte GDF15-Herunterregulation veränderte die Bildung von Zellkolonien und erhöhte das Migrationspotential. Die Proliferation dieser Zellen war jedoch kaum verändert. Im Gegensatz dazu führte eine subkutane Transplantation der shGDF15-A2780cis-Zellen in SCID-Mäusen zu einem basal erhöhten Tumorwachstum und einer signifikanten Resensitivierung gegenüber der Carboplatintherapie. Molekulare Ursachen für diesen veränderten Phänotyp in vivo waren eine Erhöhung der P53- und P16-Expression und eine Verringerung des P27-induzierten Zellzyklusarrestes. Dies ging einher mit einer erhöhten Nekrose und einer differenzierten „lobulären“ Tumorstruktur. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig gezeigt werden, dass GDF15 in einem P53- und P27-abhängigen Mechanismus die Selbsterneuerung in Tumorzellen unterstützt und somit zu einer Resistenz der A2780cis-Tumoren beiträgt. GDF15 stellt somit ein potentielles neues Target für die Entwicklung einer zielgerichteten Therapie in Patientinnen mit einem chemoresistenten Ovarialkarzinom dar.

Advanced epithelial ovarian cancer remains the most lethal gynecological malignancy due to the high risk of chemoresistance against the platinum-based standard treatment. Therefore, it is a high medical need to identify new potential factors as a basis for a targeted therapy in patients with chemoresistant ovarian cancer. Aim of this thesis was to identify resistance- related genes as potential targets for therapy of patients with platinum- resistant ovarian cancer. Therefore, the human ovarian cancer cell line A2780 and its cisplatin-resistant variant A2780cis were characterized in vitro and in vivo. Subcutaneous transplantation of A2780 and A2780cis onto immunodeficient SCID mice revealed a slower tumor growth during vehicle treatment and decreased induction of apoptosis in A2780cis tumors following carboplatin short-term treatment compared to A2780 tumors. This was associated with a lack of P27- and P53-mediated cell cycle arrest and an enhanced AKT survival signaling. Furthermore, linear model analysis was applied to the microarray-based gene expression data of short-term treated A2780 and A2780cis tumors, allowing the identification of five P53-regulated potential resistance related genes, namely SULF2, DRAM1, LMNA, P4HA2 and GDF15. Due to its high carboplatin-induced expression at the RNA- and protein-level in A2780 in vitro and in vivo, GDF15, a cytokine and member of the TGF-β-superfamily, was selected for further analyses. Although a high GDF15 RNA and protein expression was observed in A2780cis cells and A2780cis tumors at the basal level, no further enhancement of GDF-15 expression was induced by carboplatin treatment. This carboplatin-mediated GDF15 regulation was also reflected by the plasma levels of A2780- and A2780cis-bearing mice during carboplatin long- term treatment. Furthermore, GDF15 showed higher expression in advanced primary ovarian cancer tissues, which have been resected from patients during debulking surgery before chemotherapy. In order to determine the causal relationship between GDF15 and chemoresistance, a siRNA-and shRNA-mediated GDF15 knockdown in A2780cis was performed. The siRNA-mediated knockdown of GDF15 revealed a GDF15-dependent effect on SULF2 and DRAM1 expression in A2780cis cells in vitro. Moreover, the shRNA-knockdown of GDF15 in A2780cis induced a change of cell colony formation as well as an enhancement of cell migration. However, only a slight altered proliferation behavior of these cells in vitro was detected. In contrast, subcutaneous transplantation of shGDF15-A2780cis cells onto SCID mice revealed a basal enhanced tumor growth and an increased sensitivity of these tumors to carboplatin treatment as compared to the non-transduced or shTRC1-(control)-A2780cis tumors. This was associated with larger necrotic areas, a lobular tumor structure and increased P53 and P16 expression of the carboplatin treated shGDF15-A2780cis tumors. Furthermore, shRNA-mediated GDF15 knockdown abrogated the enhanced P27 expression in the non-transduced or shTRC1-(control)-A2780cis tumors. For the first time, this study shows that GDF15 contributes to chemoresistance by maintaining a quiescent, self-renewable phenotype in a P53 and P27 dependent manner. Hence, GDF15 might serve as a potential new factor for a targeted therapy in patients with ovarian cancer.