The cytoskeletal linker protein, Ezrin, inhibits α-synuclein fibrillization and toxicity by a novel mechanism

Abstract

α-synuclein - a key protein involved in Parkinson's disease (PD) - forms large insoluble deposits of amyloid fibrils that are toxic and cause the loss of dopaminergic neurons - a hallmark characteristic of PD. Some proteins (e.g. heat-shock proteins) interact with α-synuclein and interfere with aggregate formation, thereby providing a source of potential neuroprotective intervention. In this study, a library of 13,824 proteins was screened in vitro to detect inhibitors of α-synuclein fibrillization. After several stringent rounds of screening, the cytoskeletal linker protein, Ezrin, was identified as being the most potent modulator of α-synuclein aggregation. An arsenal of biophysical and biochemical assays, including atomic force microscopy, SDS-PAGE and in vitro fibrillization assays was then used to demonstrate the potency of Ezrin and closely-related family members as powerful modulators of α-synuclein fibrillization. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy studies were employed to elucidate the novel and unique mechanism by which Ezrin mediates its effect on α-synuclein fibrillization. Namely, Ezrin interacts with early-stage oligomers of α-synuclein rather than monomers to divert the protein into off-pathway, regular aggregates, structurally distinct from fibrils. Additionally, multiple cell-based assays demonstrated that Ezrin significantly reduced α-synuclein-mediated toxicity in primary neuronal cell cultures. Yeast cells overexpressing α-synuclein and Ezrin served to confirm this rescue of α-synuclein-mediated toxicity by Ezrin in an in vivo setting. Lastly, microscopy studies revealed a decrease in the number of α-synuclein aggregates formed in yeast in the presence of co- expressed Ezrin. The discovery of a novel mechanism of regulation of α-synuclein fibrillization by a cytoskeletal protein may provide insight into the cellular mechanisms of regulation of α-synuclein fibril formation. In the long run, this could uncover new aspects of the misregulation of this process in PD patients. It could also lead to a better understanding of hitherto unknown processes that may be involved in the neuropathology seen in brain tissue from PD patients. Lastly, as Ezrin is strongly expressed in the gastro- intestinal tract – a site believed by many to be the primary location for the initation of PD pathology – additional studies may shed light on the physiological onset and progression of PD as a condition that is quite commonly thought to originate in the gut.

α-Synuclein – ein Schlüsselprotein in der Parkinson Krankheit (PD) – bildet große unlösliche Ablagerungen bestehend aus Amyloidfibrillen. Diese sind toxisch und verursachen den Verlust von dopaminergen Neuronen – ein Charakteristikum der PD. Manche Proteine (z.B. Hitzeschock-Proteine) interagieren mit α-Synuclein und verhindern dessen Aggregatbildung. Sie sind somit ein Ausgangspunkt für weiterführende therapeutische Untersuchungen. In dieser Arbeit wurde daher in einer Bibliothek bestehend aus 13.824 Proteinen nach Inhibitoren der α-Synuclein Fibrillenbildung gesucht. Nach mehreren sehr stringenten Screening-Runden wurde das Zytoskelettprotein Ezrin als ein Modulator mit dem höchsten Potential identifiziert. Dieses Potential wurde durch zahlreiche biophysikalische und biochemische Methoden einschließlich Rasterkraftmikroskopie, SDS-PAGE und in vitro Fibrillisierung überprüft. Außerdem wurde auch gezeigt, dass nahverwandte Mitglieder der Ezrin-Familie, als starke Fibrillisierungsmodulatoren wirken. Nuklear-Magnet-Resonanz (NMR) Spektroskopie wurde eingesetzt, um den neuartigen Wirkmechanismus von Ezrin bei der α-Synuclein Aggregation zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass Ezrin mit kleinen, krankheitsrelevanten α-Synuclein Oligomeren aber nicht mit Monomeren interagiert. Dies führt zur Bildung von off-pathway α-Synuclein Aggregaten, die sich strukturell von Fibrillen unterscheiden. Außerdem wurde in zellbasierten Versuchen mehrfach demonstriert, dass Ezrin die α-Synuclein vermittelte Toxizität auf primäre Neurone in Kultur signifikant verringern kann. Diese Ergebnisse wurden auch in einem Hefezellmodell erfolgreich bestätigt. Schließlich konnte auch durch Mikroskopie-Studien eine Abnahme von α-Synuclein Aggregaten in Ezrin co-exprimierenden Hefezellen gezeigt werden. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass in dieser Arbeit ein neuartiger, sehr potenter α-Synuclein Fibrillisierungsinhibitor identifiziert wurde. Das Protein Ezrin wurde im Detail charakterisiert und die durchgeführten Untersuchungen lieferten wichtige Einblicke in den Mechanismus der spontanen α-Synuclein Aggregation. Gleichzeitig beweist die Arbeit durch Zell-basierte und in vivo Studien, dass Ezrin die Toxizität von α-Synuclein Aggregaten in Zellen reduzieren kann. Das Protein ist somit ein wichtiger neuer Ansatzpunkt für weiterführende therapeutische Studien. Des Weiteren führten die Untersuchungen der α-Synuclein Fibrillisierung mit Ezrin zu neuen Einblicken in die zellulären Regulations-mechanismen der α-Synuclein Fibrillenbildung in Zellen. Die Studien werfen ein neues Licht auf die Fehlregulation dieses Prozesses in PD Patienten und könnten längerfristig zu einem besseren Verständnis der Pathogenese bei PD führen. Da Ezrin verstärkt im gastro- intestinal Trakt exprimiert wird, einem Areal in dem viele Forscher den Ursprung der PD Pathologie vermuten, könnten weiterführende Studien zur Aufklärung der potentiellen Krankheitsmechanismen im Darm beitragen.