Wirkungsweise von Pathogenen, Pathobionten und Probiotika auf die epitheliale Transport- und Barrierefunktion des Darms

Abstract

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Pathogenen, Pathobionten und von Probiotika auf die intestinale Barriere- und Transportfunktion untersucht. Dies erfolgte anhand von verschiedenen Modellen der intestinalen Barriere, wie Zellkulturen, partiell gestripptem Rattendickdarm und menschlichem Dünn- und Dickdarm durch endoskopisch gewonnene Biopsien. Neben klassischen Methoden der epithelialen Transport- und Barriereforschung wie der Ussingkammer-Technik wurden molekularbiologische Methoden eingesetzt, um Funktion und Struktur zu untersuchen und diese zu korrelieren. Daneben spielten auch spezialisierte Techniken wie die Impedanzspektroskopie, die Conductance Scanning-Technik oder besondere Anwendungen der konfokalen Immunfluoreszenzmikroskopie eine wesentliche Rolle. Ausgehend von der Frage, welche Bakterien im Zellkulturmodell in der Lage sind, über die intestinale Epithelschicht zu translozieren, wurde eine neue Funktion des lange bekannten E. coli-Toxins α-Hämolysin beschrieben. Dieses Toxin gilt eigentlich als Virulenzfaktor von uropathogenen E. coli. Erstmalig konnte die Rolle dieses Toxins im Darm charakterisiert werden, wo es in der Lage ist, „focal leaks“ im Epithelzellverband zu induzieren und damit eine schwere Barrierestörung auszulösen. Diese „focal leaks“ sind Orte des Durchtritts von Bestandteilen der Mikrobiota im Sinne einer bakteriellen Translokation und damit potentieller Motor der Perpetuierung von intestinaler Inflammation wie z.B. bei CED. Alpha-Hämolysin-tragende E. coli können damit als Pathobionten bezeichnet werden, d.h. Symbionten die unter speziellen Bedingungen pathogene Eigenschaften entwickeln. Dieses Konzept konnte kürzlich im Tiermodell bestätigt werden.130 Aufgrund der Tatsache, dass im Blut von HIV-infizierten Patienten Konzentration bakterieller Bestandteile (LPS) erhöht ist, nimmt man an, dass die epitheliale Barrierestörung einen entscheidenden Anteil bei der Immunaktivierung und dem Fortschreiten der HIV-Erkrankung hat. Bei chronisch HIV-infizierten Patienten lässt sich eine Barrierestörung nachweisen, die durch den Einsatz einer hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) komplett reversibel ist. Erstmalig konnte mit Hilfe endoskopisch gewonnenen Duodenalbiopsien im Rahmen der akuten HIV-Infektion eine zeitlich früh auftretende Barrierestörung nachgewiesen werden. Hierbei fand sich als strukturelles Korrelat eine erhöhte epitheliale Apoptoserate, bedingt durch aktivierte zytotoxische T-Zellen. Mit Hilfe der speziell für endoskopisch entnommene Biopsien entwickelten Ussing-Kammer konnten zwei klinisch wichtige gastrointestinale Infektionen, die chronische Lambliasis und die akute Norovirusinfektion beim Menschen charakterisiert werden. Bei Tropenrückkehrern mit chronischer Lambliasis zeigte sich neben der bekannten malabsorptiven Veränderung der Dünndarmschleimhaut auch eine erhöhte epitheliale Apoptoserate und eine Veränderung der TJ-Proteinexpression. Dies bestätigte die vorangegangenen Zellkulturarbeiten und konnte erstmals auch beim Menschen eine epitheliale Transport- und Barrierestörung belegen. Bei der Norovirusinfektion wurden erstmals überhaupt Daten zur epithelialen Transport- und Barrierefunktion erhoben, da das Virus bislang in Zellkultur nicht anzüchtbar ist. Hierbei fand sich eine erhöhte Anzahl von aktivierten, zytotoxischen intraepithelialen Lymphozyten, verbunden mit einer Reduktion der Zottenoberfläche im Duodenum. Als Korrelat der klinisch im Vordergrund stehenden wässrigen Diarrhoe zeigte sich eine starke Aktivierung der intestinalen Chloridsekretion. Neben den Untersuchungen zu pathogenen Erregern fand sich in unserem Zellkulturmodell eine Verbesserung der Barrierefunktion nach Zugabe von E. coli Nissle 1917, einem für die Colitis ulcerosa zugelassenem Probiotikum. Hierbei wurde erstmalig eine bisher nicht bekannte Funktion eines bislang als Virulenzfaktor von uropathogenen E. coli bekannten Proteins (TcpC) beschrieben. Es führte über eine intrazelluläre Signalkaskade zu einer transkriptionellen Hochregulation des abdichtenden TJ-Proteins Claudin-14. Zusammenfassend wurde in diesen Arbeiten die vielfältige Interaktion von pathogenen Erregern und Probiotika mit der Epithelschicht des Darmes weiter aufgeklärt. Es zeigt sich dabei, dass diese Interaktion mit den Folgen einer Dysregulation der Transport- und Barrierefunktion sowohl bei klassischen gastrointestinalen Infektionen wie z.B. der Norovirusinfektion als auch bei systemischen Erkrankungen wie z.B. der HIV-Infektion eine entscheidende Rolle spielt. Die Kenntnis dieser Interaktion stellt die Basis dar für mögliche therapeutische Interventionen beispielsweise durch den Einsatz von Probiotika, wie anhand der Wirkungsweise eines einzelnen bakteriellen Proteins von E. coli Nissle 1917 dargestellt.

In the present study the influence of pathogens, pathobionts and probiotics on the intestinal barrier and transport function was investigated. This was done by means of different models of the intestinal barrier, such as cell cultures, partially stripped rat colon and human small and large intestine by endoscopically obtained biopsies. In addition to classical methods of epithelial transport and barrier research such as the Ussing chamber technique, molecular biology methods were used to investigate and correlate function and structure. Specialized techniques such as impedance spectroscopy, conductivity scanning technique and confocal immunofluorescence microscopy also played an important role. Starting from the question of which bacteria in the cell culture model are able to translocate via the intestinal epithelial layer, a new function of the long-known E. coli toxin α-hemolysin was described. This toxin is actually considered a virulence factor of uropathogenic E. coli. For the first time the role of this toxin in the intestine was characterized, where it is able to induce "focal leaks" in the epithelial cell lining and thus trigger a severe barrier dysfunction. These "focal leaks" are sites of passage of microbiota components in the sense of bacterial translocation and thus a potential motor of perpetuating intestinal inflammation, as for example in IBD. Alpha-haemolysin-expressing E. coli may thus be referred to as pathobiontes, i.e. Symbionts that develop pathogenic properties under specific conditions. This concept has recently been confirmed in an animal model. Due to the fact that the concentration of bacterial components (LPS) in the blood of HIV-infected patients is increased, the epithelial barrier disorder is thought to play a crucial role for immune activation and progress of HIV disease. In chronic HIV-infected patients, a barrier disorder can be demonstrated that is completely reversible through the use of highly active antiretroviral therapy (HAART). For the first time with the aid of endoscopically obtained duodenal biopsies an early appearing barrier dysfunction could be demonstrated in patients with acute HIV infection. Elevated epithelial apoptotic rate was found as a structural correlate, which was due to activated cytotoxic T cells. Two clinically important gastrointestinal infections, chronic giardiasis and acute norovirus infections in humans were characterized by the Ussing chamber, specially developed for endoscopically taken biopsies. In travelers returning from overseas with chronic giardiasis we found, in addition to the known malabsorptive alteration of the small intestinal mucosa, also an increased epithelial apoptosis and a change in TJ protein expression. This confirmed previous cell culture work and was able to prove an epithelial transport and barrier disturbance in humans. In the case of norovirus infection, data on the epithelial transport and barrier function have been collected for the first time, since the virus has not yet been able to propagate in cell culture. An increased number of activated, cytotoxic intraepithelial lymphocytes was associated with a reduction of the villous surface in the duodenum. A strong activation of the intestinal chloride secretion was found as a correlate of the clinically prominent watery diarrhea. In addition to the studies on pathogenic pathogens, an improvement of the barrier function was found in our cell culture model after the addition of E. coli Nissle 1917, a probiotic approved for ulcerative colitis. For the first time, a previously unknown function of a protein (TcpC), previously known as virulence factor of uropathogenic E. coli, has been described. It led to a transcriptional up- regulation of the sealing TJ protein Claudin-14 via an intracellular signal cascade. In summary, the diverse interaction of pathogens and probiotics with the epithelial layer of the intestine was further elucidated. It is shown that this interaction with the consequences of dysregulation of transport and barrier function both in classical gastrointestinal infections, e.g. Norovirus infection, as well as systemic diseases such as e.g. HIV infection plays a crucial role. The knowledge of this interaction forms the basis for possible therapeutic interventions, for example by the use of probiotics, as illustrated by the mode of action of a single bacterial protein of E. coli Nissle 1917.