Untersuchungen zum morphologischen Ablauf und zur Regulation der mitotischen Katastrophe in Kolonkarzinomzellen nach Behandlung mit Irinotecan

Abstract

Der Topoisomerase-I-Inhibitor Irinotecan (CPT-11) sowie sein aktiver Metabolit SN-38 lösen in p53wt-Kolorektalkarzinomzelllinien einen lang anhaltenden Zellzyklusarrest und in p53mut-Zellen einen transienten Arrest aus, gefolgt von Apoptose. Da die meisten Kolonkarzinome im p53-Gen eine Mutation aufweisen, ist die p53-unabhängige Apoptose von Interesse. Der Mechanismus der p53-unabhängigen Apoptose ist noch unklar. In der vorliegenden Arbeit wurden fünf etablierte p53mut-Kolonkarzinomzelllinien zur morphologischen Darstellung des Verlaufs der mitotischen Katastrophe und zur Untersuchung der Beteiligung von Cyclin D1 und der hMps1-Kinase verwendet.

Die Hauptbefunde sind: 1\. SN-38 induziert in p53mut-Zelllinien einen kurzen G2-Arrest, gefolgt von einer vorzeitigen Mitose, die in mitotischer Katastrophe mündet. Die mitotische Katastrophe wird durch aberrante Mitosen, Mikronukleationen und Kernkondensationen charakterisiert (Fig. 10). Die letzteren weisen apoptotische Charakteristika auf, wie die PARP-Fragmentierung (Fig. 13). Durch Arretierung der Zellen mit Nocodazol konnte ich zeigen, dass die SN-38-induzierte (nichtmitotische) Apoptose in HCT116 p53-/--Zellen vor und die Mikronukleation nach der Prometaphase stattfindet (Fig. 18). 2\. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass es zwei Prozesse gibt, die letztlich mit Apoptose enden: Der eine Weg führt über die Bildung von aberranten Mitosen (mitotische Katastrophe), der andere Weg, ohne Bildung von aberranten Mitosen, entspricht der klassischen Apoptose, die jedoch hier p53-Status unabhängig ist. Kennzeichnend für die mitotische Katastrophe ist das Auftreten von aberranten Mitosen als Zwischenschritt der Konversion von tetraploiden Interphase-Zellkernen zur Mikronukleation und kondensierten Kernen. 80 % der Zellen sterben jedoch auf dem klassischen Apoptoseweg ohne Mitosebeteiligung. 3\. hMps1-Kinase wird von p53 auf mRNA-Ebene reguliert (Fig 21). Dabei wirkt p21 als Verstärker der p53-vermittelten Suppression der hMps1-Kinase (Fig. 27). Im Gegensatz dazu, wird Cyclin D1 nur auf Protein- und nicht auf mRNA- Ebene durch p21 hochreguliert (Fig. 29). 4\. hMps1-Kinase-Expression nach DNA- Schädigung trägt zur Kernkondensation und PARP-Fragmentierung und damit zur Apoptose bei (Fig. 32). Die Zentrosomenamplifikation findet präferentiell in p53-/--Zellen statt, ist aber nicht von hMps1-Kinase abhängig. 5\. Die Cyclin D1-Proteinexpression wird nach SN-38-Behandlung in allen untersuchten p53wt-Zellen hochreguliert und in allen untersuchten p53mut- Zellen supprimiert (Fig. 20). Die Cyclin D1-Expression wird von p53-Protein hochreguliert und das p21-Protein ist für die p53-vermittelte Hochregulation notwendig. Das p21-Protein kann auch alleine Cyclin D1 auf Proteinebene aber nicht auf mRNA-Ebene hochregulieren (Fig. 26). Weder Überexpression noch Suppression von Cyclin D1 hat einen Einfluss auf Apoptose.

Zusammenfassend, wurden in der vorliegenden Arbeit der Ablauf der mitotischen Katastrophe charakterisiert und der molekulare Mechanismus der Beteiligung von p53 und hMps1 an diesem Prozess aufgeklärt.

The topoisomerase I inhibitor irinotecan (CPT-11) and its active metabolite SN-38 trigger a long-lasting cell cycle arrest in p53wt colorectal carcinoma cell lines and a transient arrest in p53mut cells, followed by apoptosis. p53-independent apoptosis is of interest, since most colon carcinomas show a mutation in the p53 gene, its mechanism however, is still unclear. In this study, five established p53mut colon carcinoma cell lines were used to investigate the morphological course of the mitotic catastrophe and the involvement of cyclin D1 and hMps1 kinase in this process.

The main findings of the present study are: 1\. SN-38 induces a brief G2 arrest in p53mut cell lines, followed by a premature mitosis that leads to a mitotic catastrophe. This is accompanied by aberrant mitoses, micronucleations and nuclear condensation (Fig. 10). The latter shows apoptotic characteristics such as PARP fragmentation (Fig. 13). The application of arrest induction by nocodazole and SN-38 treatment allowed to show that the prometaphase is preceded by SN-38-induced (nonmitotic) apoptosis in HCT116 p53-/-cells and followed by the micronucleation (Fig. 18). 2\. Thus two pathways lead to apoptosis: one pathway runs via aberrant mitoses (mitotic catastrophe), and the other pathway without aberrant mitoses corresponds to classical apoptosis but is p53-status independent here. Typical for the mitotic catastrophe is the occurrence of aberrant mitoses as an intermediate step in the conversion of tetraploid interphase cell nuclei to micronucleation and condensed nuclei. Eighty percent of the cells die via the classical apoptotic pathway without mitosis. 3\. hMps1 kinase is regulated by p53 at the mRNA level (Fig. 21). p21 acts as an amplifier of p53-mediated hMps1 kinase suppression (Fig. 27). In contrast, cyclin D1 is upregulated by p21 only at the protein and not at the mRNA level (Fig. 29). 4\. hMps1 kinase expression after DNA damage promotes nuclear condensation and PARP fragmentation and thus contributes to apoptosis (Fig. 32). Centrosome amplification preferentially occurs in p53-/- cells but is not dependent on hMps1 kinase (Fig. 31). 5\. Cyclin D1 protein expression is upregulated in all examined p53wt cells after SN-38 treatment and suppressed in all examined p53mut cells (Fig. 20). p53 protein upregulates cyclin D1 expression and p21 protein is necessary for p53-mediated upregulation. p21 protein can also upregulate cyclin D1 alone at the protein but not the mRNA level (Fig. 26). Neither overexpression nor suppression of cyclin D1 had an influence on apoptosis.

In sum, the present study clarifies the sequence of morphological alterations during the mitotic catastrophe and the molecular mechanism of involvement of p53 and hMps1 in this process.