Onkogen-induzierte Seneszenz in der kolorektalen Adenom-Karzinom-Sequenz und ihre Funktion als Prädiktor für das Ansprechen auf 5-FU in der primär metastasierten Situation

Abstract

Die Entstehung des kolorektalen Adenokarzinoms wird über das Mehrstufen- Karzinogenesemodell beschrieben. Neben dem programmierten Zelltod Apoptose wird auch der terminale Proliferationsarrest, die zelluläre Seneszenz, zunehmend als Schutzmechanismus der Zelle vor maligner Transformation angesehen. Diese Hypothese wird durch den Nachweis von Seneszenz in verschiedenen prämalignen Läsionen wie z.B. humanen Naevuszell-Naevi gestützt. Seneszenz kann durch die Aktivierung von Onkogenen, aber auch durch DNS- schädigende Chemotherapeutika wie 5-Fluorouracil ausgelöst werden. Seneszente Zellen zeigen charakteristische morphologische Veränderungen und die typische perinukleäre Blaufärbung im SA-beta-Gal-Assay, der nur in kryokonserviertem Material durchführbar ist. Bisher gibt es keinen alleinigen Seneszenz- spezifischer Marker, der auch in Paraffin eingebetteten Proben nachweisbar ist. In dieser Arbeit wurde untersucht, welche Rolle Seneszenz in der kolorektalen Adenom-Karzinom-Sequenz spielt und ob der Nachweis von Seneszenz in Karzinomen zum Zeitpunkt der Erstdiagnose prädiktiven Aussagewert für den Langzeitverlauf nach Chemotherapie hat. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst kryokonservierte Gewebe der kolorektalen Adenom-Karzinom-Sequenz durch den SA-beta-Gal-Assay zusammen mit immunhistochemischen Färbungen auf den Proliferationsmarker Ki67 auf Seneszenz untersucht. In kolorektalen Adenomen konnte Seneszenz in den meisten untersuchten Proben nachgewiesen werden. Die kolorektalen Karzinome zeigten überwiegend keine Seneszenz, aber hier ließen sich teilweise auch vereinzelte seneszente Areale nachweisen. Durch die Zusammenschau immunhistochemischer Färbungen verschiedener Seneszenz-assoziierter Marker konnte im nächsten Schritt ein Seneszenzindex für in Paraffin eingebettete Proben erstellt werden. Der Seneszenzindex wurde an Paraffinadenomen validiert, deren Seneszenzstatus teilweise aus Untersuchungen an korrespondierendem Kryomaterial bekannt war. Schließlich sollte der prädiktive Wert von Seneszenz auf das Therapieansprechen evaluiert werden. Hierzu wurde der Seneszenzstatus zum Zeitpunkt der Diagnose von dreißig Patienten mit fernmetastasierten kolorektalen Karzinomen ermittelt. Sie wurden mit Hilfe des Seneszenzindexes in eine seneszente und eine nicht- seneszente Gruppe aufgeteilt. Alle Patienten erhielten postoperativ eine Chemotherapie mit 5-FU/FS. Die retrospektive Analyse der Überlebensdaten zeigte mit median 12,0 versus 6,0 Monaten ein statistisch signifikant längeres progressions-freies Überleben in der seneszenten Gruppe im Vergleich zu der nicht seneszenten Gruppe. Der Seneszenzindex unbehandelter humaner Tumorproben zum Zeitpunkt der Diagnose konnte gemäß dieser Studie demnach erfolgreich als Vorhersageparameter für das Ergebnis der anschließenden Chemotherapie verwendet werden. Damit zeigt diese Studie zum ersten Mal den Zusammenhang von zellulärer Seneszenz mit dem Therapieergebnis.

The development of colorectal adenocarcinoma is described by the multi-step- carcinogenesis model. Programmed cell death (apoptosis) as well as a terminal proliferation arrest (cellular senescence) are increasingly seen as cellular failsafe mechanisms preventing malignant transformation. This hypothesis is supported by the proof of senescence in different premalignant lesions such as human nevus cell nevi. Senescence can be induced by oncogene activation or DNA-damaging chemotherapeutic agents like 5-Fluorouracil. Senescent cells display characteristic morphological changes and a typical perinuclear blue staining in the SA-beta-Gal-assay, which can only be performed in cryopreserved material. So far no single marker specific for senescence is known which can be detected in paraffin embedded samples. In this study the role of senescence in the colorectal adenoma-carcinoma-sequence was analysed, and it was determined if the detection of senescence in carcinoma at time of first diagnosis has predictive value for the long term outcome of chemotherapy. In this study cryopreserved tissue of the colorectal adenoma- carcinoma-sequence was tested for senescence by the SA-beta-Gal-assay together with immunohistochemical staining for the proliferation marker Ki67. In most of the examined colorectal adenoma samples senescence was detected. Colorectal carcinomas showed predominantly no senescence but sporadic senescent areas were found in some samples. In the next step a senescence index for paraffin embedded samples was established by looking at the immunohistochemical staining of different senescence-associated markers. The senescence index was validated in paraffin adenomas of which their senescence state was partially known from examination of corresponding cryo material. Finally the predictive value of senescence for therapy response was to be evaluated. Therefore the senescence state at time of diagnosis was determined for thirty patients with metastasized colorectal carcinoma. By applying the senescence index they were divided into a senescent and a non-senescent group. All patients received chemotherapy with 5-FU/FS postoperative. A retrospective analysis of their survival data showed a statistically significant longer progression-free survival in the senescent group in comparison to the non-senescent group (12.0 vs. 6.0 months). In this study, the senescence index of untreated human tumor samples at time of diagnosis was successful as a predictive parameter for the result of the following chemotherapy. Hereby this study shows for the first time a link between cellular senescence and therapy outcome.