Untersuchungen zur Optimierung der biologischen Aktivität von antitumoralen Platin(II)-Wirkstoffen mittels Einbindung in polynukleare Komplexe sowie in makromolekulare Träger

Abstract

In dieser Arbeit wurden zwei Ansätze zur pharmakologischen Optimierung der zytostatischen Platinverbindungen m-4F-Pt-Cl2 verfolgt. Der erste Ansatz hatte die Einbindung des 4F-Neutralliganden in kationische polynukleare Alkylaminplatinverbindungen als Ziel. Die Pharmakologie dieser Verbindungsklasse ist bisher nur in Ansätzen aufgeklärt worden. Hier konnte durch den Einsatz verschiedener Hemmstoffe die endozytotische Aufnahme in die Krebszellen nach Adsorption an die Zellmembranen gezeigt werden. Der Aufnahmeweg ist dabei vornehmlich die Makropinozytose, ein Endozytoseweg, der außer bei Krebszellen nur bei wenigen anderen Zelltypen aktiviert ist. Das Verlassen der endozytotischen Route konnte durch die Bestimmung der Platingehalte in den Zellkernen und in der DNA gezeigt werden. Der zur Zellaufnahme verfügbare Platingehalt wurde allerdings durch eine ebenfalls ausgeprägte Proteinbindung gemindert. Wurden in serumhaltigen Kulturmedium durch 10µM Substanz keine antiproliferativen Effekte an MCF-7-Zellen hervorgerufen, so zeigte dieselbe Konzentration nach sechsstündiger Inkubation in serumfreien Medium eine nachhaltige (<200h) nahezu 50%ige Hemmung des Zellwachstums. Die Anbindung von Platin über chelatisierende Endgruppen an Dendrimere führte zu einer deutlichen Erhöhung der Aufnahme der Dendrimere in MCF-7-Zellen. Zumindest kleine Platin-Dendrimer-Konjugate, bei denen das Platin über Diaminopropionsäure angebunden war, waren in der Lage, die endozytotische Route zu verlassen. So wurden sie in das Kernkompartiment aufgenommen und an die DNA gebunden. Hierbei musste das intakte Platin- Dendrimer-Konjugat in den Kern aufgenommen worden sein, da Korrelationsversuche mit einem fluoreszenz- und platinmarkierten Konjugat keine Entkopplung des Fluorophor- und Platingehalts in der Zelle gezeigt haben. So riefen diese Verbindungen in einer Konzentration von 5µM eine bis zu 50%ige Hemmung des Zellwachstums von MCF-7-Zellen hervor. Einen deutlich stärkeren antiproliferativen Effekt hatten größere Dendrimere, an die der Wirkstoff (m-4F-Pt-(H2O)2) über Dicarbonsäuren gebunden war. Die Freisetzung des Wirkstoffes aus diesen Komplexen konnte anhand eines zusätzlich fluoreszenzmarkierten Dendrimers gezeigt werden. Hier trat eine deutliche Entkopplung des Fluorophor- und des Platingehalts auf. Der kritische Parameter für die Wirksamkeit von Platin-Dendrimer-Konjugaten stellte die Bindung an Serumalbumine dar. Gegenüber wirksamen Verbindungen zeigten Verbindungen ohne antiproliferative Wirkung teilweise größere Anreicherungen in den Zellen und höhere DNA-gebundene Platingehalte. Die Bindung der unwirksamen Verbindungen an das HSA war jedoch dermaßen stark, dass nur ein geringer Anteil (<5%) der Ausgangsmenge in einer HSA-Lösung frei vorlag und somit für die Zellen verfügbar war.

This thesis deals with two ways for optimising the pharmacological properties of the cytostatic platinum lead compound m-4F-Pt-Cl2. The first attempt was the use of the m-4F neutral ligand for the building of polynuclear alkylamin platinum complexes. Till now their pharmacology was rudimentally elucidated. In this work the cellular uptake by endocytosis after adsorption at the cellular membrane could be shown. The main uptake path was the macropinocytosis, an endocytotic path activated more rarely and shortly in normal tissue than in cancer cells. The determination of platinum in the nuclei and DNA showed the escape from the endocytotic route. The amount of platinum drug available for cellular uptake was reduced by a pronounced protein binding. Hence 10µM compound caused no antiproliferative effect at MCF-7 cancer cells when incubated in serum containing medium. In contrast there was a lasting (<200h) inhibition of nearly 50% when the cells were exposed to the same concentration of compound in serum free medium for 6h. After coordination of platinum to chelating surface groups the resulting dendrimers showed a higher cellular accumulation with respect to the non platinated dendrimers. At least small platinum-dendrimer-conjugates were able to escape from the endocytotic route, so that they were taken up in the nucleus and bound to DNA. The integrity of these complexes were shown by the use of fluorescence labelled platinated dendrimers. The cellular content of platinum and fluorophor did not differ significantly. These compounds in a concentration of 5µM caused up to 50 % inhibition of cellular growth of MCF-7 cells. A distinct stronger antiproliferative effect was observed for the lead compound (m-4F-Pt-H2O-SO4) bound to dendrimers at dicarboxylic acids. The release of the drug was shown by fluorescence marked dendrimer platinates. For this compound the cellular platinum and fluorophor content was decoupled. The discerning parameter for potency of dendrimer platinates was the binding behavior to serum albumins. Compared to antiproliferative active compounds the inactive compounds showed stronger accumulation in cells and higher amounts of DNA bound platinum. But those compounds were strongly bound to HSA. So only a small amount (<5%) was recovered and therefore available for cellular uptake.