Chemoselective Modification Strategies for Peptides and Proteins in Aqueous Media

Abstract

During this thesis, we have focused on a variety of different ways of decorating peptides and proteins in a chemoselective manner. This work involves four different approaches that deal with different chemoselective labelling strategies to introduce either natural or unnatural modifications to peptides or proteins. In the first project, the traceless Staudinger ligation and its application for selective acetylation of azido lysine peptides in aqueous media was probed. Different alkyl azides were reacted with two different phosphines: 1) commercially available hydrophobic (diphenylphosphino-)methanethiol acetate and 2) water-soluble bis(p-dimethylaminoethyl)-phosphinomethanethiol acetate. The traceless Staudinger ligation was probed with an azido lysine without free amines present in the peptide. Thereby, only the water-soluble variant showed a good reactivity in aqueous buffered systems. In the second project, the thioacid–azide reaction was probed for selective acetylation of alkyl azido peptides. As alkyl azides are more electron-rich and therefore less reactive than the commonly used sulfonyl azides, a side reaction of the thioacid with basic side chains such as lysines was observed. Therefore, the reaction was probed at different pH values with an electron-rich azido butanoyl and a modestly electron-poor azido glycine peptide. At lower pH, an unexpected and different main product was observed, which was not the desired amide but a thioamide. It was shown that the ratio of thioamide and amide depends on the pH of the reaction mixture as well as on the nature of the azide, which allowed selective control over the desired product. Within the third project, a new multiple-labelling approach for proteins was probed. Selective dual- modification of a thermophilic lipase (TTL) was achieved successfully by combination of two orthogonal functionalisation strategies: oxime ligation and CuAAC. To do so, the TTL was bearing several azidohomoalanine residues, which were incorporated by selective pressure induction as methionine analogues, and an N-terminal serine, which could be post-translationally reacted with periodate to yield an aldehyde as the second bioorthogonal tag. This strategy allowed modification of the protein with two different functional moieties: galactose for carbohydrate–protein binding studies and biotin for immobilisation of the protein. With these modifications, the protein could be applied in surface plasmon resonance measurements to study their different binding to a lectin and to determine lectin binding constants. Thereby, the biotin functionalisation allowed immobilisation of our constructs on a streptavidin-coated chip, which required significantly less amounts of our proteins for the measurements.

In dieser Doktorarbeit haben wir uns mit verschiedenen Möglichkeiten der chemoselektiven Funktionalisierung von Peptiden und Proteinen beschäftigt. Dabei wurden vier verschieden wissenschaftliche Ansätze ausgewählt, die auf unterschiedlichen chemoselektiven Funktionalisierungsstrategien zur natürlichen beziehungsweise unnatürlichen Modifikation von Peptiden und Proteinen beruhen. Im ersten Projekt wurde die spurlose Staudinger Ligation bezüglich ihrer Anwedung für die selektive Acetylierung von Azidolysinpeptiden im wässrigen Medium untersucht. Dabei wurden verschiedene Alkylazide mit zwei unterschiedlichen Phosphinen umgesetzt: 1) ein kommerziell erhältliches hydrophobes und 2) ein wasserlösliches Phosphin. Die spurlose Staudinger Ligation wurde an einem Azidolysinpeptid ohne freie Amine getestet. Dabei zeigte nur das wasserlösliche Phosphin eine gute Reaktivität bezüglich des Azidolysinpeptids in wässrigen Puffersystemen. Im zweiten Projekt wurde die Thiosäure–Azid Reaktion bezüglich ihrer Anwendbarkeit auf die selektive Acetylierung von Alkylazidpeptiden untersucht. Da Alkylazide generell elektronenreicher und damit weniger reaktiv sind als die herkömmlich verwendeten Sulfonylazide, konnten unter pH-neutralen Reaktionsbedingungen eine Nebenreaktion mit basischen Aminosäureseitenketten wie Lysin beobachtet werden. Aus diesem Grund wurde die Reaktion bei unterschiedlichem pH-Wert mit zwei verschiedenen Aziden getestet. Bei niedrigeren pH-Werten wurde ein unerwartetes neues Hauptproduckt beobachtet, bei welchem es sich nicht um das erwünschte Acetamid sondern um ein Thioacetamid handelte. Zusammenfassend haben unsere Ergebnisse gezeigt, dass das Verhältnis zwischen Thioamid und Amid sowohl vom pH-Wert der Reaktion als auch von den elektronischen Eigenschaften des Azides abhängt, was eine Kontrolle über das gewünschte Endprodukt erlaubt. Im dritten Projekt wurde ein neuer Multi- Funktionalisierungsansatz für Proteine untersucht. Durch die Kombination zweier orthogonaler Funktionalisierungsstrategien, der Oxim-Ligation und der CuAAC, konnte eine thermophile Lipase (TTL) erfolgreich zweifach modifiziert werden. Um das zu erreichen, besaß die TTL mehrere Azidohomoalanin-Reste, die mittels selektiver Druckinduktion als Methionin-Analoga eingebaut wurden, sowie ein N-terminales Serin, welches posttranslational mittels Periodat in ein Aldehyd als zweite bioorthogonale Gruppe überführt werden konnte. Diese Strategie ermöglichte die Funktionalisierung des Proteins mit zwei unterschiedlichen Molekülen: Galactose zur Erforschung von Kohlenhydrat- Protein Interaktionen und ein Biotin für eine zusätzliche Immobilisierung des Proteins. Diese beiden Modifikationen ermöglichten es schließlich, das Protein mittels Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie zu untersuchen und somit eventuelle Bindungen unserer Proteinkonjugate mit Lektinen sowie spezifischen Bindungskonstanten zu bestimmen.