Ermittlung von Einflussfaktoren auf die intra vitam Diagnostik der Paratuberkulose

Abstract

Die intra vitam Diagnostik der Paratuberkulose ist heute mit direkten und indirekten Nach-weisverfahren möglich. Die kulturelle Anzüchtung des Krankheitserrergers Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (Map) aus dem Kot infizierter Tiere mit anschließender molekularbiologischer Speziesbestätigung wird derzeit als hochspezifische intra vitam Goldstandardmethode bei der Validierung serologischer Paratuberkulose- Nachweisverfahren angewendet. In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Gegenüberstellung und Bewertung der Befunde der kulturellen Anzüchtung von Map aus Rinderkot sowie der Untersuchungsergebnisse zweier blut- und milchserologischer Paratuberkulose-Testverfahren aus 3 Thüringer Milchvieh- betrieben. Methoden- als auch tierspezifische Faktoren, die möglicherweise die Ergebnisse der einzelnen Testverfahren beeinflussten, wurden untersucht. Ein Einfluss der folgenden methodischen Faktoren auf die Kultivierung des Erregers aus dem Kot wurde nachgewiesen: die Lagerung der Kotproben, die Hexadecylpyridiniumchlorid-Einwirkzeit sowie die Anzahl eingesetzter Kulturröhrchen pro Kotprobe. Besonders die Erhöhung der Anzahl der Kotkulturröhrchen ermöglichte eine Steigerung der Sensitivität der kulturellen Anzüchtung von Map aus Rinderkot. Währenddessen in einem Bestand tierspezifische Einflüsse auf den kulturellen Map-Nachweis nicht zu ermitteln waren, wurden im Vergleichsbestand Einflüsse des Alters sowie der Laktationsphase auf die Map-Kotausscheidung und den Erfolg der Anzucht nachgewiesen. Die Map-Nachweisrate war dabei ab einem Alter von 4 Jahren und in der 3. Laktationsphase signifikant höher. Daneben wurde der Erreger in diesem Bestand auch signifikant häufiger bei Tieren mit reduzierter Milchleistung detektiert. Durch die Wiederholung kotkultureller Untersuchungen konnte der Anteil ermittelter Ausscheider in zwei Paratuberkulosebeständen signifikant gesteigert werden, somit wurde auch die Sensitivität der Methode mit jeder Wiederholungs-untersuchung erhöht. Die Sensitivität zweier Paratuberkulose-Blut- und Milch-ELISA-Testverfahren (Svanovir- und Pourquier- ELISA) zum Nachweis von Antikörpern erwies sich bei der Untersuchung subklinisch infizierter Tiere als unzureichend. Ein Einfluss der untersuchten Tierpopulation, der aktuellen Stärke der Map-Kotausscheidung sowie des Alters auf die Sensitivitäten der blut- und milchserologischen Tests war nachweisbar. Eine stetige Zunahme seropositiver Befunde wurde bei infizierten Tieren mit steigendem Alter beobachtet. Der Anteil positiver Befunde war bei aktuell starker Map-Ausscheidung signifikant höher. Für den Svanovir- und Pourquier- Blut-/Milch-ELISA waren die Testsensitivitäten bei infizierten Tieren mit Milchleist- ungen zwischen 5 und 35 kg am Untersuchungstag am höchsten. Daneben war die Sensitivität des Svanovir-Milch-ELISA in der 3. Laktationsphase signifikant erhöht. Die Testspezifität wurde anhand der Untersuchungsergebnisse aus einem Paratuberkulose unverdächtigen Bestand berechnet. Für den Pourquier-ELISA wurden gute Spezifitäten, die nicht durch tiereigene Faktoren beeinflusst wurden, ermittelt. Die Testspezifitäten des Svanovir-ELISA erwiesen sich als unzureichend und wurden mit zunehmendem Lebensalter der Tiere weiter signifikant reduziert. Die Spezifitäten des Svanovir-Milch-ELISA waren bei Tagesmilchmengen unter 25 kg und in der 3. und 4. Laktationsphase vermindert. Methodische Einflüsse der Milchinhaltsstoffe auf die milchserologischen Untersuchungs-verfahren konnten nicht sicher ausgeschlossen werden, mit hoher Wahrscheinlichkeit sind die ermittelten Signifikanzen jedoch sekundär bedingt und auf veränderte Milchmengen und Laktationsstadien zurück zu führen. Bei der Wiederholung serologischer Untersuchungen erhöhten sich die Sensitivitäten beider ELISA-Testverfahren nur unzureichend, die Spezifität des Svanovir-ELISA wurde jedoch signifikant reduziert. Auch die Übereineinstimmungen der Befunde beider ELISA-Testver- fahren erwiesen sich als gering. Nur für den Pourquier-ELISA wurden bei der Untersuchung von zeitgleich entnommenem Blut- und Milchserum identischer Tiere gute Überein-stimmungen ermittelt. Aus den Ergebnissen der durchgeführten Studie kann geschlussfolgert werden, dass zur intra vitam Einzeltierdiagnostik der Paratuberkulose derzeit ausschließlich die Kultivierung von Map aus Kot, unter standardisierten Bedingungen, empfohlen werden kann. Der Nachweis des Erregers im Kot infizierter Tiere wird dabei besonders durch methoden- und bestandsspezifische Faktoren beeinflusst, optimale Probenentnahmezeitpunkte wurden nicht ermittelt. Auch die Untersuchung junger Tiere erbrachte in den vorliegenden Untersuch-ungen hohe Nachweisraten und ist deshalb ebenso wie die häufige Wiederholung der koprologischen Untersuchungen zu empfehlen. Als wichtigste tierspezifische Einflussfak- toren auf die serologischen Testverfahren sind die aktuelle Stärke der Map-Kotausscheidung und das Alter der Tiere hervor zu heben. Die Anwendung des Svanovir-ELISA ist aufgrund unzureichender Testspezifitäten zur Paratuberkulosediagnostik nicht empfehlenswert. Die geringen Sensitivitäten des Pourquier-ELISA limitieren die Aussagekraft des Testverfahrens sehr stark, jedoch kann der Test aufgrund seiner guten Spezifität für Screening-Untersuch- ungen in großen Herden angewendet werden. Dabei ist die Untersuchung von Milchproben gleichwertig gegenüber blutserologischen Untersuchungen.

The diagnosis of paratuberculosis is possible via direct and indirect verification procedures. Today cultivation of faeces for the detection of the causative agent Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (Map) and its molecular confirmation is the most recommended, highly specific intra vitam goldstandard method for the validation of serological paratuber-culosis tests. In the present thesis results of faecal cultivation and diagnostic findings of two blood and milk ELISA tests were compared and evaluated. Faeces, blood and milk samples were collected in 3 Thuringian dairy farms. Methodical effects and influences emanated from the animals that potentially affected the diagnostic techniques were analyzed. An impact of the following methodical factors on the faecal cultivation of Map was observed: storage of faecal samples, length of Hexadecylpyridiniumchlorid decontamination and number of culture slants used per faecal sample. Especially a higher number of culture slants increased the sensitivity of Map-cultivation. In one of the examined paratuberculosis herds influences on faecal culture results caused by the tested animals were not detectable, while impacts of the age and lactation stage on the cultivation of Map were determined in the other herd. Verification of Map in infected animals was significantly higher in animals older than 4 years and during the 3rd lactation stage. Additionally, shedding of Map was detected more frequently in animals with reduced milk yields (< 25 kg). The repetition of faecal culture raised the number of detected shedders and the sensitivity of the method significantly. The sensitivity of two blood and milk ELISA tests (Svanovir- and Pourquier-ELISA) proved to be insufficient in subclinically infected animals. The examined cattle population, the intensity of faecal shedding as well as the age of the animals influenced sensitivities of both serological tests. A continuing raise of seropositive test results was noticed with increasing age of infected animals. The proportion of positive serological test results was significantly higher in animals that were heavily shedding Map and for animals with daily milk yields between 5 and 35 kg. Moreover, an increase of the Svanovir milk ELISA sensitivity was detected for animals tested during the 3rd lactation stage. The diagnostic findings in a paratuberculosis nonsuspicious herd were used for the calculation of the ELISA specificity. For the Pourquier-ELISA sufficient specificities were calculated that were not significantly influenced by the animals properties. Test specificities of the Svanovir-ELISA turned out to be deficient and were additionally reduced by an increasing age of the examined cattle. Furthermore, the specificity of the Svanovir milk ELISA decreased when the daily milk yield of the tested animals was lower than 25 kg or when samples were taken during the 3rd or 4th lactation period. Methodical effects on the serological milk tests caused by the milk ingredients were possible and could not be excluded, though the probability that the calculated statistical significances occurred secondary due to changing milk yields and lactation stages was most likely. Repetition of serological tests adduced an unsatisfactory raise of all ELISA test sensitivities but caused a significant reduction of the Svanovir blood and milk ELISA specificities. The agreement of the test results for the two paratuberculosis ELISA tests was not sufficient. Using the Pourquier-ELISA, excellent agreement of the test results was determined for blood and milk samples that were taken simultaneously from identical animals. In conclusion the present study revealed that only faecal culture under standardized conditions can be recommended for the intra vitam diagnosis of paratuberculosis in individual animals. Detection of Map in faeces of infected animals is mainly affected by methodical and herd specific factors, an ideal point of time for faecal sampling was not determined. The examination of faeces of young animals proved to be effective and can be advised as well as the repeated testing of faecal samples. The most important factors that influenced serological test results were the intensity of faecal shedding and the age of the examined animals. Because of the low test specificity the application of the Svanovir-ELISA for the diagnosis of paratuberculosis was evaluated to be unsuitable. The low sensitivity of the Pourquier-ELISA limited the test validity heavily, but as a result of its sufficient specificity, the test can be recommended for screening surveys in large dairy herds. For this purpose the examination of milk samples is adequate to the analysis of blood samples