Untersuchung der Funktion von Ahnak1 in der Regulation des kardialen L-Typ- Ca2+-Kanals

Abstract

Einleitung: Im Herzen ist der spannungsabhängige L-Typ-Ca2+-Kanal (Cav1.2) für den kontrollierten Ca2+-Einstrom (ICaL) in die Zelle und die damit verbundene Erregungs- Kontraktions-Kopplung verantwortlich. Die Interaktion der β2-Untereinheit (β2-UE) mit der porenbildenden α1C-Untereinheit ist sowohl für den Transport des Kanals zur Zellmembran als auch für die Aktivierung und Inaktivierung des Ca2+-Kanals essentiell. Ahnak1 ist ein 700 kDa großes Gerüstprotein, welches mit der β2-UE des kardialen Ca2+-Kanals interagiert. Bisherige Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Ahnak1 eine Rolle in der Regulation des L-Typ-Ca2+-Kanals spielt. In dieser Arbeit wurde die Funktion von Ahnak1 in der Regulation des Ca2+-Kanals auf struktureller und funktioneller Ebene untersucht. Methodik: Ca2+- und Ba2+-Ströme durch den L -Typ-Ca2+-Kanal wurden mittels der Patch-Clamp-Technik an isolierten ventrikulären Kardiomyozyten gemessen. An diesen isolierten Zellen wurden Ahnak1 und die β2-UE immunzytochemisch lokalisiert. Zur Untersuchung der Herzfunktion von Ahnak1-Knock-Out (KO)-Mäusen wurde die Methode des isoliert perfundierten Herzens nach Langendorff angewandt. Interaktionen zwischen Ahnak1 und der β2-UE des Ca2+-Kanals wurden mittels Ultrazentrifugation, Oberflächen-Plasmon-Resonanz und Immunassays studiert. Die strukturellen Analysen wurden mit Hilfe der Circulardichroismus-Spektroskopie und der Massenspektrometrie durchgeführt. Ergebnisse: Die morphologische Untersuchung von Ahnak1-KO-Kardiomyozyten ergab eine signifikante Verkürzung der Zellen. Ahnak1-defiziente Kardiomyozyten wiesen einen reduzierten ICaL und eine beschleunigte Inaktivierung des Ca2+-Stroms auf. Damit übereinstimmend zeigten weitere Ca2+- und Ba2+-Strommessungen an Wildtyp-Kardiomyozyten, dass die intrazelluläre Perfusion mit einem Fragment des distalen C-Terminus von Ahnak1 die Inaktivierung des Ca2+-Kanals verzögert. In Ahnak1-KO- Kardiomyozyten hingegen wurde die Inaktivierung durch die Ahnak1-Perfusion nicht modifiziert. Am gesamten Herzen im Langendorff-Modell zeigten sich keine Unterschiede zwischen Ahnak1-KO und dem Wildtyp. Die Herzen von Ahnak1-KO- Mäusen konnten genauso stark durch Adrenalin stimuliert werden wie die des Wildtyps. Auch Ahnak1-KOKardiomyozyten zeigten eine intakte Isoprenalin (ISO)-Stimulation. Die Perfusion von Wildtyp-Kardiomyozyten mit einem Peptid P4984 des proximalen C-Terminus von Ahnak1 hatte jedoch eine reduzierte Antwort auf den β-adrenergen Rezeptor-Agonisten ISO zur Folge. Auch dieser modulatorische Effekt (auf die Kanalaktivität) wurde, ähnlich wie für die Inaktivierung beobachtet, in Ahnak1-KO-Kardiomyozyten nicht gefunden.Erstmals konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass Ahnak1 und die β2-UE in den T-Tubuli isolierter Kardiomyozyten kolokalisieren. Interaktionsstudien zwischen Ahnak1 und der β2-UE zeigten, dass zwei im C-Terminus von Ahnak1 lokalisierte PxxP-Motive wichtig für die hochaffine Bindung zwischen beiden Proteinen sind. Weiterhin wurde in der β2-UE die zentrale Region, bestehend aus einer SH3 (Scr-Homologie-3)-Domäne, einer HOOK und einer Guanylatkinase (GK)-Domäne, als Interaktionsregion für den C-Terminus von Ahnak1 kartiert. Innerhalb der GK-Domäne der β2-UE konnte Ser-296 als neue Phosphorylierungsstelle für Proteinkinase A (PKA) identifiziert werden. Die PKA-vermittelte Phosphorylierung von Ser-296 an der β2-UE erhöhte zudem die Bindungsaffinität zu Ahnak1. Schlussfolgerung: Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass Ahnak1 als positiver Regulator des L-Typ-Ca2+-Kanals wirkt. Ahnak1-Defizienz und Applikation von Ahnak1- Fragmenten modulierten neben basaler Stromdichte und Inaktivierungskinetik auch die β-adrenerge Regulation des ICaL.

Introduction: The voltage-dependent L-type Ca2+ channel (Cav1.2) is crucial for the Ca2+ entry (ICaL) into cells to initiate the excitation-contraction coupling in the heart. The interaction of the β2 subunit with the pore-forming α1C subunit of Cav1.2 is essential for channel trafficking to the plasma membrane and for the activation as well as the inactivation of the Ca2+ channel. Ahnak1, a 700kD scaffold protein interacts with the β2 subunit of the cardiac Ca2+ channel. Previous findings indicate that Ahnak1 plays a role in the regulation of this channel. In the present study, structure-function analyses of Ahnak1 regarding the L-type Ca2+ channel regulation were performed. Methods: Ca2+ and Ba2+ currents through the L-type Ca2+ channel were recorded using the patch clamp technique on isolated ventricular cardiomyocytes. In the same isolated cells the subcellular localization of Ahnak1 and β2 was studied by immunocytochemistry. The isolated perfused heart according to Langendorff was used to investigate the cardiac function of Ahnak1-KnockOut (KO) mice. Interaction studies between Ahnak1 and the β2 subunit of the Ca2+ channel were performed by ultracentrifugation, surface plasmon resonance, and immunoassays. For structural analysis circular dichroism spectroscopy and mass spectrometry were applied. Results: A morphological analysis of isolated cardiomyocytes revealed that cells from Ahnak1-KO mice were shorter than those isolated from wild type (WT) littermates. Ahnak1-KO cardiomyocytes displayed a reduced ICaL and an accelerated inactivation of the calcium current. These results are in line with current recordings on WT cardiomyocytes intracellularly perfused with an Ahnak1 C-terminal fragment that decelerated the inactivation. Applying this fragment on Ahnak1-KO cardiomyocytes did not modify the inactivation. The analysis of the cardiac function of isolated hearts indicated no difference between Ahnak1-WT and Ahnak1-KO. Hearts from Ahnak1-KO mice could be stimulated by isoprenaline (ISO) just as well as hearts from WT mice. Additionally, Ahnak1-KO cardiomyocytes showed an intact ISO stimulation. However, intracellular perfusion of WT cardiomyocytes with an Ahnak1 peptide P4984 markedly reduced calcium current response to the beta-adrenergic agonist ISO. This modulatory effect was not observed in Ahnak1-KO cardiomyocytes, similar to the inactivation in KO cells. For the first time it was shown that Ahnak1 and the β2 subunit co-localize in the t-tubular invaginations of isolated cardiomyocytes. Interaction studies between Ahnak1 and β2 revealed that two PxxP motifs located in the C-terminus of Ahnak1 are essential for the high-affinity binding between both proteins. Furthermore, it was found that the core region of β2 consisting of Src-homology 3 (SH3), HOOK, and guanylate kinase (GK) domains is crucial for the interaction with the C-terminus of Ahnak1. Within the GK domain of β2, Ser-296, a novel phosphorylation site for protein kinase A (PKA) could be identified. The PKA-mediated phosphorylation of Ser-296 on β2 increased the binding affinity with Ahnak1. Conclusion: The results of this study suggest that Ahnak1 acts like a positive regulator of the L-type Ca2+ channel. Ahnak1-KO and application of Ahnak1 fragments modified the basal current density, inactivation kinetics, and the beta- adrenergic regulation of ICaL.