dc.contributor.author
Bogenhagen, Thekla
dc.date.accessioned
2018-06-07T15:34:34Z
dc.date.available
2017-03-03T10:30:46.281Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/1284
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-5486
dc.description
Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 1.1 Hepatitis-B-Virus-Infektion
............................... 1 1.1.1 Epidemiologie
.................................. 1 1.1.2
Pathogenese................................... 2 1.1.3
KlinischesErscheinungsbild........................... 4 1.1.4
Diagnose..................................... 4 1.1.5
Prävention.................................... 6 1.1.6
Therapieindikationen&Therapie........................; 7 1.2
DasHepatitis-B-Virus.................................. 9 1.2.1
GeschichtedesHepatitis-B-Virus........................ 9 1.2.2
KlassifikationdesHepatitis-B-Virus....................... 10 1.2.3 Morphologie
und Genomstruktur des Hepatitis-B-Virus . . . . . . . . . . . . 12 1.2.4
DerHBV-Lebenszyklus ............................. 13 1.3 DerNrf2-ARE-Signalweg
................................ 16 1.3.1 Nuclear Factor-Erythroid 2-related
Factor 2 (NRF2) . . . . . . . . . . . . . . 16 1.3.2
Antioxidantresponsiveelement(ARE)..................... 17 1.3.3 ARE-
regulierteGene .............................. 17 1.3.4
RegulationderAktivitätundStabilitätvonNrf2. . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.3.4.1 Keap1 ................................ 19 1.3.4.2 SmallMaf-
Proteine.......................... 20 1.3.5 Interaktion von Nrf2 mit
intrazellulären Signalwegen . . . . . . . . . . . . . 21 1.3.5.1
ProteinkinaseC............................ 21 1.3.5.2 Mitogen-
aktivierteProteinkinasen .................. 22 1.3.5.3
Phosphatidylinositol-3-Kinase .................... 23 2 Ziel der Arbeit 27 3
Material 28 3.1 Zellen,TiereundGewebeproben ............................ 28
3.1.1 ProkaryotischeZellen .............................. 28 3.1.2
EukaryotischeZellen............................... 28 3.1.3
Tiere....................................... 29 3.1.4
Gewebeproben.................................. 29 i 3.2
Plasmide......................................... 29 3.3 Oligonukleotide
..................................... 29 3.4
Antikörper........................................ 30 3.5
Größenstandards..................................... 31 3.6 Enzyme
......................................... 31 3.7 ReagenzienfürdieZellkultur
.............................. 32 3.8
Inhibitoren........................................ 32 3.9 Chemikalien
....................................... 32
3.10PharmazeutikaundMedizinprodukte.......................... 33 3.11Kits
........................................... 33
3.12Geräte.......................................... 34 3.12.1
Elektrophorese.................................. 34 3.12.2 Mikroskopie
................................... 34 3.12.3
Bildgebung.................................... 34 3.12.4 Real-TimePCR
................................. 34 3.12.5 Zentrifugen
................................... 34 3.12.6
AndereGeräte.................................. 35
3.13Verbrauchsmaterialien.................................. 35
3.14PufferundLösungen .................................. 36
3.15Software......................................... 38 4 Methoden 39 4.1
Zellbiologie........................................ 39 4.1.1
ProkaryotischeZellkultur ............................ 39 4.1.2
EukaryotischeZellkultur............................. 39 4.1.2.1
KultivierenundPassagieren ..................... 39 4.1.2.2 Zellzählung
.............................. 39 4.1.3 TransfektionvonHuh7.5-Zellen
........................ 40 4.1.4
ErnteundLyseeukaryotischerZellen...................... 40 4.1.4.1
Proteinlysate für Western-Blot-Analysen . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.1.4.2 ProteinlysatefürELISA........................ 40 4.2
MolekularbiologischeMethoden............................. 40 4.2.1 Agarose-
Gel-Elektrophorese .......................... 40 4.2.2 BestimmungvonDNA-&
;RNA-Konzentrationen; . . . . . . . . . . . . . . . 41 4.2.3
IsolierungvonPlasmid-DNA .......................... 41 4.2.4 RNA-Isolierung
................................. 41 4.2.5 cDNA-Synthese
................................. 42 4.2.6 Real-TimePCR
................................. 42 4.3
ProteinbiochemischeMethoden............................. 43 4.3.1 Protein-
Quantifizierung mittels Bradford-Methode . . . . . . . . . . . . . . . 43
Inhaltsverzeichnis ii 4.3.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) . .
. . . . . . . . . . . . 43 4.3.3 Western-Blot-
Analyse.............................. 44 4.4 ImmunologischeMethoden
............................... 45 4.4.1 Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay
..................... 45 4.4.2 Immunfluoreszenz&Immunhistochemie;
.................... 45 4.4.2.1 Indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie . . . .
. . . . . . . . . . . 45 4.4.2.2 IndirekteImmunhistochemie
..................... 46 4.5 Mikroskopie
....................................... 46 4.5.1 KonfokaleLaser-Scanning-
Mikroskopie..................... 46 4.6 CharakterisierungHBV-transgenerMäuse
....................... 46 4.6.1 BestimmungHBV-
transgenerMäuse...................... 46 4.6.2
UntersuchungbiochemischerBlutparameter . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
4.6.2.1 UntersuchungdesAST-undALT-Gehaltes . . . . . . . . . . . . . 47 4.6.3
Partielle2/3-Hepatektomie........................... 47 4.6.4 Leberentnahme
................................. 48 4.6.5 HerstellungvonLeberlysaten
.......................... 48 4.6.6 RNA-
IsolierungausLebergewebe........................ 49 4.6.7 Histologie
.................................... 49 4.6.7.1 Hämatoxylin-Eosin- & van
Gieson-Färbung . . . . . . . . . . . . . 49 4.6.7.2 IndirekteImmunhistochemie
..................... 49 4.6.7.3 BrdU-Immunhistochemie ......................
49 4.6.7.4 TUNEL-Assay............................. 50 4.7 Statistik
......................................... 50 5 Ergebnisse 51 5.1 Einfluss von
HBV auf Proteine der Insulin-Signalkaskade und des Glukosestoffwechsels 51
5.1.1 Erhöhte Menge an Insulin-Rezeptor in HBV-replizierenden Zellen in vitro
und invivo...................................... 51 5.1.2 HBV beeinflusst
nicht die Menge des Insulin-like-growth-factor-Rezeptors und Insulinrezeptor-
Substrats-1 ........................... 54 5.1.3 Vermehrte Expression des
Glukose-1-Transporters (GLUT-1) in HBV-positiven Zellen
...................................... 55 5.1.4
KeinEinflussvonHBVaufdiePhosphoglyceratkinase. . . . . . . . . . . . . 57 5.2
Analyse des Einflusses von HBV auf die Insulin-/IGF-1-Signalkaskade . . . . .
. . . 58 5.2.1 Phosphorylierung des IR- und IGF-1-Rezeptors nach Stimulation
mit Insulin in HBV-replizierendenZellen ........................... 58 5.2.2
Vermehrte Aktivierung des IRS-1-Tyrosin in HBV-positiven Zellen bei gle-
ichzeitiger Stimulation mit Insulin und Glukoseoxidase . . . . . . . . . . . .
. 61 5.2.3 Keine Phosphorylierung der c-jun N-terminal Kinase durch
Stimulation mit GlukoseoxidaseinHBV-positivenZellen .................... 64
Inhaltsverzeichnis iii 5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.3.4 5.3.5 6 Diskussion Erhöhte
Menge des Insulin-Rezeptors in HBV-transgenen Mäusen . . . . . . 66 Keine
veränderte Expression von GLUT-1 und PGK in HBV-transgenen Mäusen 68 Keine
histologischen Veränderungen in Lebern von HBV-transgenen Mäusen . Verminderte
Leberregeneration in HBV-transgenen Mäusen nach partieller Hepatektomie
.................................. Keine Apoptoseinduktion durch partielle
Hepatektomie in HBV-transgenen Mäusen ..................................... 69
71 73 76 77 82 85 88 90 93 114 115 116 6.1 Der Insulin-/IGF-1-Signalweg und
seine Aktivierung in HBV-replizierenden Zellen . . 6.2 Verzögerte
Leberregeneration in HBV-transgenen Mäusen . . . . . . . . . . . . . . . 7
Zusammenfassung 8 Abstract 9 Abkürzungsverzeichnis 10 Literaturverzeichnis 11
Publikationsverzeichnis 12 Danksagung 13 Selbständigkeitserklärung
dc.description.abstract
Das humane Hepatitis-B-Virus (HBV) ist ein 42 nm großes partiell
doppelsträngiges DNA-Virus, das der Familie der Hepadnaviridae zugeordnet wird
[Modrow et al., 2010]. Infektionen mit HBV können akute und chronische
Leberentzündungen hervorrufen und gelten als einer Hauptrisikofaktiren für
hepatozelluläre Karzinome (HCC), welche die häufigste Form der malignen
Lebertumoren darstellen [Schaedler et al., 2010]. Eine verminderte
Leberregeneration begünstigt hierbei die Entstehung einer Leberfibrose
beziehungsweise -zirrhose und führt zu einem Verlust von funktionellem
Leberparenchym [Lok and McMahon, 2007]. Ein wichtiger regulatorischer Faktor
für die Leberregeneration ist der Transkriptionsfaktor nuclear factor
E2-related factor 2 (Nrf2). Dieser bindet an die antioxidant response elements
(ARE)-Region verschiedener Gene und kontrolliert so die Expression von
Proteinen, die für Detoxifikation und Elimination von Elektrophilen und ROS
zuständig sind und liegt vermehrt in HBV-positiven Zellen vor [Nguyen et al.,
2009, Schaedler et al., 2010]. Darüber hinaus konnte in Nrf2-knock-out-Mäusen
nach partieller Hepatektomie eine verminderte Leberregeneration beobachtet
werden. Dies ist durch einen erhöhten ROS-Spiegel bedingt, der zu einer
Hemmung der insulinab- hängigen Signaltransduktion führt [Beyer et al., 2008].
Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Einfluss des HBV auf die
Insulin-/IGF-1-Signalkaskade und der Einfluss von Nrf2 auf die
Leberregeneration in HBV-positiven Zellen untersucht werden. Zunächst wurde
die Mengen wichtiger Proteine der Insulin-Signalkaskade im Western Blot
analysiert. Diese zeigten, dass in HBV-replizierenden Zellen eine signifikant
höhere Menge an Insulin-Rezeptor enthalten ist, wohingegen weder die Menge des
Insulin-like-growth-factor-Rezeptor (IGF-Rezeptors) noch des Insulinrezeptor-
Substrats-1 (IRS-1) verändert ist (siehe Kapitel 5.1, Abbildung 5.1, Abbildung
5.5 und Abbildung 5.6). Die höhere Expression des Insulin-Rezeptors wurde
anschließend in transient transfizierten HBV-replizierenden Zelllinien durch
Immunfluoreszenzuntersuchungen bestätigt. Der Rezeptor scheint jedoch
internalisiert und nicht plasmamembranassoziiert vorzuliegen (siehe Kapitel
5.1, Abbildung 5.2). Da auch die IR-mRNA-Mengen in HBV-replizierenden Zellen
erhöht sind, kann von einer heraufgesetzten Expression und nicht von einer
verminderten Rezeptordegradation ausgegangen werden (siehe Kapitel 5.1,
Abbildung 5.3). Eine der möglichen Erklärungen hierfür wäre eine Insulin-
Rezeptor-Retention durch α-Taxilin, welches den intrazellulären
Vesikeltransport inhibiert und in HBV-replizierenden Zellen in erhöhter Menge
vorliegt [Hoffmann et al., 2013]. Aufgrund der erhöhten IR-Menge in HBV-
replizierenden Zellen in vitro wurden diese Ergebnisse auch in in vivo
verifiziert, sowohl durch Verwendung von HBV-transgenen Mäusen als auch durch
Leberschnitte von HBV-infizierten Patienten (siehe Kapitel 5.1, Abbildung 5.4
und Kapitel 5.3.1, Abbildung 5.17). Um mehr Informationen über die Aktivierung
des Insulin-/IGF-1-Signalweges zu bekommen, wur- den anschließend stabil HBV-
replizierende Hepatoblastomzellen und Kontrollzellen mit Insulin und
Glukoseoxidase stimuliert, um kontinuierlichen ROS durch Wasserstoffperoxid zu
erzeugen (siehe Kapitel 6, Abbildung 6.1). Die Daten bestätigen, dass der
Insulin-/IGF-1-Signalweg auf der Rezep- torebene sowohl in HBV-positiven als
auch in HBV-negativen Zellen normal aktiviert wird. Die Aktivierung in HBV-
replizierenden Zellen ist sogar höher als die in negativen Zellen, wenn
gleichzeitig mit Insulin und Glukoseoxidase stimuliert wird (siehe Kapitel
5.2.1, Abbildung 5.10). Da HBV eine Aktivierung der Nrf2-/ARE-abhängig
regulierter Gene bewirkt, könnte dies ein Mechanismus sein, um das Überleben
der infizierten Zellen zu sichern, die Immunantwort zu modifizieren und somit
die Infektion zu manifestieren [Schaedler et al., 2010]. Eine Studie mit Nrf2
-knockout-Mäusen konnte zeigen, dass die Phosphorylierung von IRS-1 an Tyrosin
als Folge einer Insulinstimulation deutlich vermindert war nach partieller
Hepatektomie. Dies scheint der Grund für eine Insulinresistenz in Nrf2
-knockout-Hepatozyten zu sein, da die IR-Phoyphorylierung normal war [Beyer
and Werner, 2008, Beyer et al., 2008]. Die Phosphorylierung von IRS-1 an Serin
in HepAD38 und HepG2.2.15, welche mit Glukoseoxidase stimuliert wurden, ist
deutlich vermindert verglichen mit HBV-negativen Zellen (siehe Kapitel 5.2.2,
Abbildung 5.12). Dies zeigt einmal mehr, dass HBV-positive Zellen verglichen
mit HBV-negativen Zellen weniger durch ROS beeinträchtigt werden. Die
Aktivität von JNK als ein Mediator der Insulinresistenz durch Phosphorylierung
von IRS-1 an Serin ist reduziert in HBV-replizierenden Zellen, obwohl mehr p
-IRS-Ser vorliegt (siehe Kapitel 5.2.2, Abbildung 5.12 und Kapitel 5.2.3,
Abbildung 5.14) [Beyer et al., 2008]. Dies bestärkt die Vermutung, dass
mindestens eine weitere Kinase neben JNK die Phosphorylierung an IRS
reguliert. Zusammenfassend konnte in HBV-replizierenden Zellen gezeigt werden,
dass erhöhte ROS-Level nicht die Aktivierung des Insulin-/IGF-1-Signalweges
beeinträchtigen. Jedoch könnte ROS durch das Immunsystem vor allem durch
zytotoxische T-Zellen deutlich ausgeprägter in vivo sein. Uner- warteterweise
weisen HBV-positive Zellen deutlich höhere Mengen des Insulin-Rezeptors auf,
die jedoch internalisiert vorliegen. In zukünftigen Exerimenten sollte
untersucht werden, ob der Rezeptor wirklich normal zur Zellmembran
transportiert wird oder dieser internalisiert akkumuliert und eventuell doch
zu reduzierter Insulinbindung führt. In Nrf2-knockout Mäusen kommt es nach
partieller Hepatektomie zu einer verzögerten Leberregenera- tion [Beyer et
al., 2008]. Deshalb war es überaus interessant zu untersuchen, ob die
Leberregeneration in HBV-transgenen Mäusen ebenfalls reduziert ist im
Vergleich zu C57BL/6-Kontrolltieren. Es konnte gezeigt werden, dass weibliche
HBV-transgene Mäuse eine reduzierte und männliche HBV-transgene Mäuse eine
verzögerte Leberregeneration verglichen zu C57BL/6-Kontrolltieren aufweisen
(siehe Kapitel 5.3.4, Abbildung 5.23). Zusätzlich wurden die beiden
Transaminasen ALT und AST im Serum nach Hepatektomie bestimmt, um den
aufgetretenen Leberschaden zu ermitteln (siehe Kapitel 5.3.5, Abbildung 5.24
und 5.25). Die zunächst erhöhten AST- und ALT-Werte nach Hepatektomie lassen
sich vor allem auf die chirurgische Intervention zurückführen und nicht auf
eine erhöhte Apoptose. Um dies zu bestätigen, wurden zusätzlich ein TUNEL-
Assay und ein cleaved-PARP-ELISA durchgeführt. Zusammenfassend zeigen diese in
vivo-Daten, dass eine beieinträchtigte Regeneration vorliegt, hierbei scheint
sich jedoch um einen von Nrf2 unabhängigen Prozess zu handeln, da HBV die
Expression der Nrf2-/ARE-regulierten Proteine induziert [Schaedler et al.,
2010]. In weiteren Experimenten sollte der Probenumfang erhöht werden und es
wäre interessant zu wissen, ob die BrdU-positiven Zellen HBV-positive oder
negative Zellen sind. So könnte festgestellt werden, ob beide Zellen
gleichermaßen auf den Regenerationsreiz der Hepatektomie reagieren. Darüber
hinaus wäre es interessant zu wissen, ob eine unterschiedliche Regeneration
nach CCl4-induzierter Leberschädigung erfolgt.
de
dc.description.abstract
The human hepatitis B virus (HBV) is a 42nm partially double-stranded DNA-
virus belonging to the familiy of hepadnaviridae [Modrow et al., 2010].
Infection with HBV can cause acute or chronic inflammation of the liver and is
considered to be a major etiological factor in the development of human
hepatocellular carcinoma (HCC) [Schaedler et al., 2010]. A decreased level of
liver regeneration promotes the development of fibrosis and liver cirrhosis
leading to a loss of liver function [Lok and McMahon, 2007]. An important
regulatory factor for the control of liver regeneration is the transcription
factor nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2). Nrf2 binds to antioxidant
response elements (ARE) and thereby triggers the expression of cytoprotective
proteins [Nguyen et al., 2009, Schaedler et al., 2010]. This factor regulates
the expression of antioxidant proteins important for reactive oxygen stress
(ROS) detoxification and is upregulated in HBV-positive cells [Schaedler et
al., 2010]. Recently, it was shown that Nrf2-deficient mice show an impaired
liver regeneration due to an elevated ROS level that results in insulin and
IGF resistance [Beyer et al., 2008]. In this study, the interference between
HBV and insulin-dependent signaling pathways should be investigated in more
detail to characterize the influence of Nrf2 on liver regeneration in HBV-
positive cells. First of all, Western-Blot-analyses, investigating the amount
of key proteins of the insulin signaling pathway, showed that the level of
insulin receptor in HBV-positive cells is significantly increased, whereas the
insulin like growth factor receptor (IGF-1R) and the insulin receptor
substrates (IRS) are not affected (see chapter 5.1, fig. 5.1, fig. 5.5 and
fig. 5.6). This was confirmed by analyzing transiently transfected cells by
confocal immunofluorescence microscopy. The transiently transfected cells
revealed higher IR amounts compared to HBV-negative controls, but the receptor
seemed to be internalized instead of plasmamembrane-associated (see chapter
5.1, fig. 5.2). Since IR-mRNA levels are increased in HBV-replicating cells,
it is to be assumed that elevated IR levels are due to increased expression
and not to decreased receptor degradation (see chapter 5.1, fig. 5.3). A
possible explanation could be an insulin receptor retention by α-taxilin,
which is increased in HBV replicating cells, inhibiting the intracellular
vesicular trafficking [Hoffmann et al., 2013]. Based on the higher IR amounts
in HBV-positive cells in vitro, this data were also verified in in vivo models
including both, HBV-transgenic mice and livers of HBV-infected patients (see
chapter 5.1, fig. 5.4 and chapter 5.3.1, fig. 5.17).In order to get more
information about the activation of the insulin signaling pathway, stable HBV-
expressing and HBV-negative control cells were stimulated with insulin and
glucose oxidase to initiate continuous ROS via hydrogen peroxide (see chapter
6, fig. 6.1). The data confirm that the insulin signaling pathway is activated
at the level of the insulin receptor in HBV-positive as well as in HBV-
negative cells. Activation in HBV-positive cells is even higher if stimulated
simultaneously with insulin and glucose oxidase (see chapter 5.2.1, fig.
5.10). As HBV induces a strong activation of Nrf2-/ARE-regulated genes, this
might ensure survival of the infected cell, shape the immune response to HBV
and thereby promotes the establishment of the infection [Schaedler et al.,
2010]. A recent study in Nrf2-deficient mice showed that tyrosine
phosphorylation of the IRS-1 and PI3K activation in response to insulin was
inhibited in the regenerating liver after partial hepatectomy. This is most
likely responsible for the insulin/IGF-1 resistance in Nrf2-deficient
hepatocytes, since IR phosphorylation occurred normally [Beyer and Werner,
2008, Beyer et al., 2008]. Serine phosphorylation of IRS in glucose oxidase-
treated HepAD38 and HepG2.2.15 is decreased compared to HBV-negative cells
(see chapter 5.2.2, fig. 5.12). Once more this claims a minor impairment of
the insulin signaling pathway in HBV-positive cells by ROS compared to HBV-
negative cells. JNK is a mediator of insulin resistance by phosphorylating
IRS-1 at serin and thereby inhibiting its phosphorylation at tyrosine [Beyer
et al., 2008]. However, in HBV-replicating cells the activity of JNK is
reduced and there is an increased amount of p-IRS-Ser (see chapter 5.2.2, fig.
5.12 and chapter 5.2.3, fig. 5.14). This indicates that another kinase besides
JNK regulates IRS phosphorylation as well. In summary, HBV induces the
expression of ARE-regulated genes by activation of Nrf2 [Schaedler et al.,
2010]. However, increased ROS-level in chronic HBV-infections do not impair
the insulin/IGF-pathway. Nevertheless, ROS induced by an immune response
especially by cytotoxic T-cells might be more pronounced in vivo.
Unexpectedly, it could be shown that HBV expressing cells possess increased
amounts of insulin-receptors. In future experiments, it should be investigated
whether the receptor is properly translocated to the cell membrane or
accumulates intracellularly leading to reduced insulin binding. Nrf2-deficient
mice showed a delayed liver regeneration after partial hepatectomy [Beyer et
al., 2008]. Therefore, it was tempting to analyze whether liver regeneration
is impaired in HBV transgenic mice as well. It was found that female HBV
transgenic mice have a reduced and male HBV transgenic mice have a delayed
liver regeneration compared to wild type mice (see chapter 5.3.4, fig. 5.23).
In addition, serum alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase
were analyzed to determine liver damage after hepatectomy (see chapter 5.3.5,
fig. 5.24 and 5.25). Nevertheless, increased level of serum transferases after
hepatectomy due to the surgical intervention and not to apoptosis. This was
confirmed by a TUNEL Assay and a cleaved PARP ELISA. Taken together, these
results indicate that impaired liver regeneration seems to be independent of
Nrf2, since HBV induces expression of Nrf2-/ARE-regulated Proteins [Schaedler
et al., 2010]. In future experiments, it could be investigated whether the
BrdU-positive cells are HBV-positive or -negative cells and whether they
respond equally to hepatectomy. Moreover, it would be interesting to see if a
different regeneration of liver damage occurs after carbon tetrachloride
(CCl4) treatment.
en
dc.format.extent
iv, 116 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Hepatitis B virus
dc.subject
electrophoresis
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft
dc.title
Interferenz des Hepatitis-B-Virus mit insulinabhängig regulierten Signalwegen
dc.contributor.contact
thekla.bogenhagen@gmail.com
dc.contributor.firstReferee
Univ.-Prof. Dr. Ralf Einspanier
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Eberhard Hildt
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Benedikt Kaufer
dc.date.accepted
2017-02-20
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000104252-8
dc.title.translated
Interference of Hepatitis B Virus with insulin-dependent signaling pathways
en
refubium.affiliation
Veterinärmedizin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000104252
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000021132
dcterms.accessRights.dnb
free
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open access