Multiple anti-tumoral properties of a whole mistletoe extract viscumTT in osteosarcoma

Abstract

Osteosarcoma is the most primary bone tumor and its peak incidence occurs in the second decade in children and adolescents. Diseases like retinoblastoma or Li-Fraumeni syndrome predisposed osteosarcoma at higher risk. Generally, high grade osteosarcoma is associated with bad chemotherapy response, rising chemotherapy resistances, poor prognosis and outcome. New therapy approaches and drug discovery are essential for the improvement of survival. Complementary mistletoe therapy is widespread in the European countries and is applied mainly as adjuvant therapy in adult tumors. Commercial Viscum album preparations are water-based, contain mainly mistletoe lectins and viscotoxins but hydrophobic triterpene acids are nearly not included. These triterpene acids were solubilized by 2-hydroxypropyl-ß- cyclodextrins for our studies. Both hydrophilic as well as hydrophobic substances possess high anti-tumoral properties. By combining an aqueous (viscum) and a triterpene acid (TT) extract a whole mistletoe extract (viscumTT) was recreated and their unified anti-tumoral potential was investigated in pediatric osteosarcoma. In this work, viscum, TT and viscumTT inhibited proliferation and induced apoptosis in a dose- and cell line-dependent manner. Additionally, viscumTT-mediated effect was always synergistic and nearly same effective in each tested cell line by seemingly non-essential role of TP53 in vitro. Mistletoe extracts mainly induced caspase-dependent apoptosis by triggering intrinsic and extrinsic components. High anti-tumoral effect was confirmed in an osteosarcoma xenograft model in vivo as viscumTT was also more effective than the single extracts. A closer look to alterations in cell cycle progression gave insights into molecular mechanism of action. Viscum arrested cell cycle either in G1 phase in TP53 wild-type and null-mutant cells or in S phase in TP53 mutant cells, whereby TT led to G1 arrest in each cell line. ViscumTT did not change arrested stadium by single extracts except in TP53 mutant cells as no distinct cell cycle arrest was detectable. ViscumTT-mediated alterations resulted from induced gene expression by single extracts by up-regulation of GADD45A and CDKN1A as well as down-regulation of SKP2 whereas the effect was lower in TP53 null mutant cells. Further investigations indicated the role of GADD45A and CDKN1A also in induction of apoptosis. Additionally, viscumTT triggered environmental stress response via MAPK8 activation as well as inactivation of survival associated pathways MAPK1/3 and STAT3. Especially, BIRC5 and MYC that are often associated with poor prognosis were down-regulated. Moreover, viscumTT-mediated synergistic effect might be based on a complex interaction of targets that were affected by viscum and TT as single extracts. All findings of this work could qualify viscumTT as high potential promising therapy approach for osteosarcoma patients.

Das Osteosarkom ist der häufigste primäre Knochentumor mit einem erhöhten Vorkommen im zweiten Lebensjahrzehnt bei Kindern und jungen Erwachsenen. Genetische Prädispositionen, wie das Retinoblastom oder Li-Fraumeni Syndrom, erhöhen das Risiko, an einem Osteosarkom zu erkranken. Es ist mit einem schlechten Ansprechen auf Chemotherapie, erhöhtem Risiko für Chemotherapieresistenzen und schlechter Prognose assoziiert. Das macht die Entwicklung neuer Medikamente und Therapieansätze essentiell. Die Misteltherapie wird in der komplementären Medizin in Europa bei Erwachsenentumoren häufig angewendet. Kommerzielle Präparate beinhalten hauptsächlich hydrophile Bestandteile, wie die Mistellektine und Viscotoxine. Hydrophobe Substanzen, wie die Triterpensäuren, die durch 2-Hydroxypropyl-ß-Cyclodextrin für unsere Studien solubilisiert wurden, sind so gut wie nicht enthalten. Allerdings besitzen sowohl die hydrophilen als auch die hydrophoben Bestandteile eine hohe antitumorale Wirksamkeit. Durch die Kombination eines wässrigen (viscum) und eines lipophilen (TT) Extraktes wurde ein Gesamtmistelextrakt (viscumTT) hergestellt und auf dessen antitumorale Eigenschaften im Osteosarkom untersucht. In dieser Arbeit zeigten viscum, TT und viscumTT eine konzentrations- und zelllinienabhängige Inhibierung der Proliferation sowie Induktion der Apoptose. Darüberhinaus erzielte viscumTT immer einen synergistischen und nahezu gleichen Effekt in den hier getesteten Zellen, in dem TP53 scheinbar keine essentielle Rolle spielte. Die Mistelextrakte induzierten unter der Beteiligung von intrinsischen und extrinsischen Komponenten Caspase-abhängig Apoptose. Der hohe antitumorale Effekt wurde in einem Osteosarkom Modell in vivo bestätigt, in dem viscumTT auch eine höhere Wirksamkeit als die Einzelextrakte aufwies. Untersuchungen des Zellzyklus zeigten, dass viscum TP53-Wildtyp und -Nullmutante Zellen in G1 oder TP53-Mutante Zellen in S Phase arrestierte, während TT in allen Zelllinien einen G1 Arrest induzierte. ViscumTT führte ebenfalls zu einem G1 Arrest, allerdings zu keinem eindeutigen Zellzyklusarrest in TP53-Mutante Zellen. Die durch viscumTT induzierten Zellzyklusveränderungen basierten auf der Wirkung der Einzelextrakte durch die Hochregulation der Gene GADD45A und CDKN1A sowie durch die Herunterregulation von SKP2. Außerdem waren GADD45A und CDKN1A auch an der Induktion der Apoptose beteiligt. ViscumTT aktivierte die stressinduzierte Signalantwort über MAPK8 und inaktivierte zellwachstumsstimulierende Signalwege wie MAPK1/3 und STAT3. BIRC5 und MYC, die mit einer schlechten Prognose assoziiert sind, wurden herunterreguliert. Der Synergismus von viscumTT resultierte vermutlich aus einem komplexen Zusammenspiel verschiedener Zielproteine, ausgelöst durch die Einzelextrakte viscum und TT. Alle Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen das hohe therapeutische Potential von viscumTT als ein möglicher, neuer Therapieansatz für Osteosarkom Patienten.