Are retroviruses involved in the etiopathogenesis of autoimmune diseases?: Development and application of test systems for the detection of retroviral gene expression

Abstract

The etiopathogenesis of most autoimmune diseases (AIDs) is not yet understood. The clinical pictures of retrovirus infected animals and the presence of cross-reactive antibodies against retroviral antigens, which are detectable in serum samples from AID patients, suggest a role of retroviruses in the etiology of such diseases. A considerable part of the human genome consists of human endogenous retrovirus (HERV) sequences, and several studies implied that expression of normally quiescent HERV sequences might be involved in AID development. However, so far no virus or HERV expression could be linked clearly to the etiopathogenesis of one of the AIDs studied in this work (MS, scleroderma, SLE, spondylitis ankylosans).

In order to clarify the conflicting results which were obtained with different methods and materials in various laboratories over time, highly sensitive methods were needed. In this study, the differential display was modified as a retrovirus generic screening tool for cell culture material. The Mg2+ based reverse transcriptase (RT) activity assay was optimized and Mn2+ was introduced as second cation. In order to determine the potential effect of HERV expression, a panel of quantitative RT real-time PCRs was established. The sensitivity, reliability, and suitability of the assays for cell culture supernatants and plasma was demonstrated. Samples from children and adolescents with early onset MS (EOMS), or affected by active MS at the time of sampling and from adults with MS were analyzed in comparison to those from healthy individuals, from children and adolescents affected by neurological diseases and from adults affected by non-MS autoimmune diseases (scleroderma, SLE, spondylitis ankylosans).

Plasma samples from scleroderma, SLE, and spondylitis patients were analyzed for RT activity. None of the patients showed elevated RT activity in comparison to healthy controls. Thus, it seems to be unlikely that exogenous retroviruses are involved as infectious agents in the etiopathogenesis of the AIDs examined. The expression patterns for three different HERV sequences showed significant differences for groups of healthy controls compared to diseased individuals, and for children and adolescents in comparison to adults. The different groups of children and adolescents showed no significant differences in the HERV expression patterns when compared to age-matched controls, except for young male MS patients with active MS at the time of sampling. Significantly higher expression of the three HERV sequences was detected for male children/adolescents with active MS in comparison to healthy and age-matched males. In contrast to other studies, no elevated expression of any of the tested HERV sequences was detected for MS patients. Spondylitis ankylosans patients showed significantly lower expression of MSRV and HERV-W, while SLE patients showed significantly higher expression of HERV-W when compared to healthy controls.

Different expression levels were detected for healthy children/adolescents in comparison to healthy controls for two of three HERV sequences (HERV-H and MSRV). These findings suggest that HERV expression may vary with age.

Die Aetiopathogenese der meisten Autoimmunerkrankungen ist bislang unverstanden. Die klinischen Bilder von retroviralen Erkrankungen bei Tieren sowie kreuzreaktive Antikoerper, die im Serum von Autoimmunpatienten nachweisbar sind, lassen vermuten, dass Retroviren an der Aetiologie solcher Erkrankungen beteiligt sein koennten. Ein betraechtlicher Teil des humanen Genoms besteht aus humanen endogenen retroviralen (HERV) Sequenzen, und Untersuchungen implizieren, dass die Expression von normalerweise stummen HERV-Sequenzen in die Entstehung von Autoimmunkrankheiten involviert sein koennte. Jedoch konnte bisher noch kein Virus oder die Expression von HERV- Sequenzen klar mit der Aetiopathogenese der Autoimmunkrankungen, die in dieser Arbeit untersucht wurden (MS, Sklerodermie, SLE, Spondylitis Ankylosans), in Verbindung gebracht werden.

Um die widerspruechlichen Ergebnisse, die in unterschiedlichen Studien mit verschiedenen Methoden und Materialien im Laufe der Zeit erzielt wurden, zu klaeren, wurden hoch sensitive Methoden benoetigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Differential Display als generische Screening Methode zur Detektion von Retroviren fuer Zellkulturueberstaende adaptiert. Der Mg2+-basierte reverse Transkriptase (RT) Aktivitaets-Assay wurde optimiert und Mn2+ wurde als zweites Kation eingefuehrt. Um den potenziellen Effekt der HERV-Expression zu untersuchen, wurden quantitative real-time PCRs etabliert. Die Sensitivitaet, Stabilitaet und Eignung der Assays wurde fuer Zellkulturueberstaende und Plasma gezeigt. Es wurden Proben von Kindern und Jugendlichen mit frueher MS (early onset MS, EOMS), mit aktivem MS-Schub, sowie Proben von erwachsenen MS-Patienten im Vergleich mit Proben von Gesunden, mit Proben von Kindern und Jugendlichen, die an verschiedenen neurologischen Erkrankungen litten und von Erwachsenen, die eine von drei nicht-MS-Autoimmunerkrankungen hatten (Sklerodermie, SLE, Spondylitis Ankylosans), untersucht.

Plasmaproben von Sklerodermie-, SLE- und Spondylitis-Patienten wurden auf RT- Aktivitaet untersucht. Keiner der Patienten hatte im Vergleich mit der Kontrollgruppe erhoehte RT-Aktivitaet. Somit erscheint eine Beteiligung von exogenen Retroviren an der Aetiopathogenese der untersuchten Erkrankungen unwahrscheinlich. Die Expressionsmuster der drei untersuchten endogenen retroviralen Sequenzen ergaben signifikante Unterschiede fuer die Gruppen der Gesunden im Vergleich mit Erkrankten, sowie im Vergleich von gesunden Kindern und Jugendlichen mit Erwachsenen. Die verschiedenen Gruppen der Kinder und Jugendlichen zeigten im Vergleich keine signifikanten Unterschiede in der Expression von HERV-Sequenzen mit Ausnahme von maennlichen Jugendlichen, die zur Zeit der Probennahme unter einem akuten MS-Schub litten. Bei ihnen wurde eine signifikant hoehere Expression aller drei retroviralen Sequenzen im Vergleich mit gesunden Kontrollen im gleichen Alter festgestellt. Im Gegensatz zu anderen Studien wurde keine generell erhoehte Expression von HERV-Sequenzen fuer MS-Patienten gefunden. Spondylitis-Patienten hatten eine signifikant niedrigere Expression von MSRV und HERV-W, waehrend SLE-Patienten eine signifikant hoehere Expression von HERV-W im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe hatten.

Es wurden unterschiedliche Expressionslevel von gesunden Kindern und Jugendlichen im Vergleich zu Erwachsenen fuer zwei von drei HERV-Sequenzen (HERV-H und MSRV) gezeigt. Dieses Ergebnis laesst vermuten, dass die Expression einiger HERV-Sequenzen mit dem Alter variiert.