Adoptive zelluläre Immuntherapie:: Untersuchungen der Funktionalität von Dual-T-Zellrezeptor-T-Lymphozyten

Abstract

Die Reprogrammierung von T-Zellen durch T-Zellrezeptor- (T cell receptor, TCR) Gentransfer würde die Herstellung von spezifischen Immunzellen für die adoptive zelluläre Immuntherapie erleichtern. TCR-reprogrammierte T-Zellen besitzen exo- und endogene TCR. Bisher ist wenig darüber bekannt, inwieweit sich diese zwei verschiedenen TCR auf einer T-Zelle beeinflussen, da meist die Spezifität des endogenen TCR unbekannt ist. Die wichtigsten Fragen sind, ob exo- und endogene TCR-Ketten hybride TCR und folglich neue Spezifitäten bilden und ob Dual-TCR-T-Zellen, die über einen TCR aktiviert wurden, den zweiten TCR nutzen, um Effektorfunktionen auszuüben. Mäuse, die für die Gene zweier TCR transgen sind, können Dual-TCR-T-Zellen generieren und erlauben die Analyse von T-Zellen mit zwei bekannten Spezifitäten. Wir generierten OT-I/P14 Dual- TCR-transgene- (Dtg) T-Zellen, die für Ovalbumin- (ova257) und Lymphochoriomeningitisvirus-Glykoprotein-Peptide (gp33) spezifisch sind. Beide antigenen Peptide induzieren Proliferation und IFNγ-Produktion der OT-I/P14 Dtg-T-Zellen. Obwohl die Expressionshöhe des einen TCR (P14) auf Dtg-T-Zellen reduziert ist, ähnelt die Peptidsensitivität dieser Zellen der von Einzel-TCR- transgenen- (single TCR transgenic, Stg) T-Zellen der gleichen Spezifität. OT-I/P14 Dtg-T-Zellen exprimieren vorrangig TCR, die sich aus den verwandten TCR-Ketten zusammensetzen, obwohl OT-I- und P14-TCR-Ketten in P14/OT-Iβ- transgenen und P14β-tansduzierten OT-I T-Zellen hybride Heterodimere unbekannter Spezifität bilden können. Die Stimulation eines TCR auf Dual- TCR-T-Zellen beeinflusst die Expression des zweiten, unstimulierten TCR nicht direkt. Die TCR-Herabmodulation auf Dual-TCR-T-Zellen ist hauptsächlich von der Bindung des spezifischen Liganden abhängig. In vivo vermitteln Dtg T-Zellen nach Stimulation über einen der beiden TCR Effektorfunktionen über beide TCR. Adoptiv transferierte Dtg-T-Zellen unterdrücken das Wachstum von B16-ova und B16-gp33 Tumoren, unabhängig davon, ob sie mit ova257- oder gp33-Peptiden in vitro aktiviert werden. Der adoptive Transfer von OT-I/P14 Dtg-T-Zellen löst in Mäusen, die Ova als Autoantigen in den β-Zellen des Pankreas exprimieren, Autoimmunität aus. Abhängig von der Höhe der Ova- Expression induzieren Dtg-T-Zellen schweren (in RIP-mOva) bzw. milden Diabetes mellitus (in RIP-Ovalo Mäusen), unabhängig davon, ob sie über den OT-I oder P14 TCR aktiviert werden. Zusammengenommen wurde in dieser Arbeit ein Modell der TCR-Gentherapie etabliert, in dem die Konditionen und Konsequenzen der funktionellen Expression von exogenen TCR-Genen untersucht werden können.

Grafting T cells with new antigen specificity by T cell receptor (TCR) gene transfer could greatly facilitate adoptive T cell immunotherapy. TCR- redirected T cells possess exogenous and endogenous TCR. Little is known about how two TCR on one T cell influence each other. This is often due to the fact that the specificity of the endogenous TCR is unknown. Major questions are, whether exogenous and endogenous TCR chains develop hybrid TCR and consequently new specificities and whether dual-TCR T cells, which were activated through one TCR can use the second TCR for effector functions. Mice, which are transgenic for the genes of two different TCR can generate dual-TCR T cells and allow the analysis of T cells with two known specificities. We have generated OT-I/P14 dual-TCR transgenic (Dtg) T cells specific for ovalbumin (ova257) and lymphocyte choriomeningitis virus glycoprotein (gp33) peptides. These cells can be stimulated by either antigenic peptide to proliferate and produce IFNγ. Even though one TCR (P14) is expressed at reduced levels on dual-TCR T cells, the peptide sensitivity of these cells is similar to that of single-TCR transgenic (Stg) T cells of the same specificity. TCR expressed by OT-I/P14 Dtg T cells consist mainly of cognate TCR-chains, although OT-I and P14 TCR chains can develop hybrid heterodimers with unknown specificities in P14/OT-Iβ-transgenic and P14β-tansduced OT-I T cells. Stimulation of one TCR on Dual-TCR-T cells does not directly influence the expression level of the second TCR. TCR down-modulation on dual-TCR T cells depends primarily on binding of the specific ligand. In vivo, Dtg T cells mediate effector functions via both TCR after stimulation through either TCR. Adoptively transferred Dtg T cells suppress the growth of both, B16-ova und B16-gp33 tumours, regardless of the peptide (ova257 or gp33) used for previous in vitro activation. The adoptive transfer of OT-I/P14 Dtg T cells induces autoimmunity in mice, which express ova as self-antigen in pancreatic β-cells. Dependent on the expression level of ova, OT-I/P14 Dtg T cells induced severe (in RIP-mOva) or mild diabetes (in RIP-Ovalo mice), regardless whether they were activated via the OT-I or P14 TCR. Taken together, we established a model of gene therapy to analyse conditions and consequences of functional expression of exogenous TCR genes.