Degradation of intracellular retained V2 vasopressin receptor mutants

Abstract

The V2 vasopressin receptor (V2R) belongs to the family of G protein-coupled receptors (GPCR), which regulate essential signal transduction pathways including the V2R-mediated vasopressin-activated water reabsorption in the collecting duct of the kidney. More then 170 different mutations of the gene encoding for the V2R are described to cause nephrogenic diabetes insipidus, a severe disorder characterized by polyuria and polydipsia. The mutations are evenly spread over all the domains of the receptor and may lead to V2R mutants that are retained by the protein quality control system in several compartments of the secretory pathway. The mutants investigated in the present study were localized in the ER, in the ER-Golgi intermediate compartment (ERGIC), and in the Golgi apparatus. This thesis aimed to characterize their degradation pathways. Protein degradation is necessary to maintain normal cellular homeostasis. Many human diseases are caused through the accumulation of unfolded or misfolded proteins in the ER. First, the quality control system tries to refold improperly folded polypeptides to achieve their native and transport-competent conformation. If the amount of misfolded proteins exceeds the capacity of the folding machinery, their accumulation can induce the unfolded protein response, which activates the ER-associated degradation (ERAD) pathway. This study demonstrates that the quality control system determines the degradation pathway of V2Rs. Wild-type and mutant receptors with folding defects are recognized by the quality control system of ER (wild- type, L62P), ERGIC (V226E) and Golgi apparatus (G201D). Komplex-glycosylated receptors that are able to pass the quality control of the ER and ERGIC are degraded in lysosomes. All misfolded, immature receptor forms are subsequently eliminated via the ERAD. The V2Rs co-precipitate with a canonical ERAD component, the AAA ATPase p97/valosin-containing protein (p97/VCP). p97/VCP participates in all known ERAD pathways and is presumably involved in the extraction of proteins out of the ER membrane. The inhibition of proteasomal degradation enhances the interactions between V2Rs and components of the retrotranslocation machinery. In addition, V2Rs with mutations in different receptor domains (L62P, cytosolic; V226E, transmembrane; G201, ER-luminal) can be co-precipitated with the potential channel protein Derlin-1. This is in striking contrast to recently published results obtained in yeast, where three distinct ERAD pathways operate. The findings presented here demonstrate that only one p97/VCP / Derlin-1-dependent ERAD pathway degrades receptors bearing different misfolded domains in a mammalian system. Moreover, co-precipitated Rpt1, a regulatory subunit of the 19S particle of the 26S proteasome, was pulled down with all immature V2Rs. Until now, it is not fully understood which subunit of the 19S complex facilitates the recognition of polyubiquitinated substrates targeted for degradation by the proteasome. Rpn10, a non-ATPase subunit of the regulatory particle, could not be detected in V2R samples even though both Rpt1 and Rpn10 are described to bind polyubiquitin chains. One may hypothesize that the Rpt1 subunit facilitates recognition and binding of V2Rs to the proteasome and leads to their final degradation.

Der Vasopressin-V2-Rezeptor (V2R) gehört zu der Familie der G Protein- gekoppelten Rezeptoren und wird über den sekretorischen Transportweg zur Plasmamembran transportiert. Dort vermittelt der Rezeptor die anti-diuretische Wirkung des Hormons Vasopressin. Durch Mutationen im APVR2-Gen, welches für den V2R kodiert, kommt es zu V2R Mutanten, die durch die veränderte Proteinfaltung einen Transportdefekt aufweisen können. Sie werden von der Qualitätskontrolle der Zelle erkannt und in allen Kompartimenten des sekretorischen Transportwegs retiniert: im ER (L62P), im ER-Golgi Intermediär Kompartiment (ERGIC) (V226E) oder Golgi-Apparat (G201D). Durch die intrazelluläre Retention wird das Krankheitsbild des Nephrogenen Diabetes insipidus (NDI) verursacht. Für die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase ist das Gleichgewicht zwischen Abbau und Neusynthese von Proteinen eine essentielle Vorraussetzung. Die Anhäufung von fehlerhaften Proteinen aktiviert daher einen protektiven Mechanismus, die „Unfolded protein response“ (UPR). Eine Folge der UPR-Signaltransduktion ist die Aktivierung der ER- assozierten Protein Degradation (ERAD). Das Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der Degradationswege unterschiedlicher V2R Mutanten. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass das Qualitätskontrollsystem bestimmt, welcher Degradationsweg eingeschlagen wird. Komplex-glykosylierte Wildtyp-Rezeptoren und im Golgi-Apparat retinierte G201D Mutanten konnten die Qualitätskontrolle von ER und ERGIC passieren und in Lysosomen lokalisiert werden. Alle kernglykosylierten, unreifen Rezeptorformen, einschließlich der Wildtyp- Rezeptoren, wurden vom lysosomalen Abbau ausgeschlossen. Die unreifen Rezeptorformen konnten ERAD Komponenten kopräzipitieren, wurden polyubiquitinyliert und proteasomal degradiert. Alle unreifen Rezeptoren interagieren mit einem zentralen ERAD Protein, der AAA ATPase p97/Valosin- containing protein (p97/VCP), welches in allen bekannten ERAD Wegen an der Translokation beteiligt ist. Auch ein weiteres ER-Membranprotein, Derlin-1, wurde von allen Rezeptoren kopräzipitiert. Die genaue Funktion des Proteins ist nicht bekannt, aber Derlin-1 ist nicht in allen beschriebenen ERAD Wegen von Bedeutung. Deshalb werden ERAD-Wege nach der Derlin-1-Beteiligung unterschieden. Carvalho et al. konnten zeigen, dass es in der Hefe Saccharomyces cerevisiae drei unterschiedliche ERAD Wege gibt; Derlin-1 ist dabei nur am Abbau von Proteinen mit luminal-lokalisierten Mutationen beteiligt. Dazu stehen die Ergebnisse dieser Studie in starkem Kontrast: ein Derlin-1 / p97/VCP abhängiger ERAD Weg baut Rezeptoren mit Mutationen in unterschiedlichen Rezeptordomänen (L62P, cytosolisch; V226E, transmembranär; G201D, luminal) in humanen Zellen ab. In einer massenspektrometrischen Analyse wurde eine ATPase Untereinheit des regulatorischen 19S Unterkomplexes des Proteasoms (Rpt1) identifiziert, welche vom V2R kopräzipitiert wurde. Diese Untereinheit bietet die Möglichkeit, eine Hypothese für den bisher unbekannten Mechanismus der Substraterkennung durch das Proteasom aufzustellen. Dabei binden freie Rpt1-Untereinheiten retrotranslozierte V2 Rezeptoren und ermöglichen so die Proteasomrekrutierung oder Assemblierung.