Untersuchungen zur Haploidspezifität des t-Komplex Responders bei der nicht- Mendelschen Vererbung in der Maus

Abstract

Die nicht-Mendelsche Vererbung des t-Haplotyps von heterozygoten Mausmännchen an ihre Nachkommen ist unter der Bezeichnung Transmission Ratio Distortion bekannt. Der t-Haplotyp, eine abweichende Form des t-Komplexes, erstreckt sich über fast ein Drittel des Mauschromosoms 17 und codiert mehrere Distortergene und ein Respondergen, die in der Spermatogenese zur Ausbildung von zwei verschiedenen Spermienpopulationen führen. Die früh exprimierten Distorter wirken auf Signalkaskaden einer Spermienmotilitätskinase, Smok1, und haben eine negative Wirkung auf die Motilität aller Spermien, während der Responder diese Situation nur in Spermien, die das Respondergen tragen, wieder ausgleicht. Dies verschafft den sogenannten t-Spermien einen Vorteil bei der Befruchtung und führt zu der ungewöhnlich hohen Vererbung. Vorangegangene Arbeiten haben gezeigt, dass ein responderbasiertes Transgen haploidspezifische Transkriptexpression aufweist, das heißt, die mRNA ist haploidspezifisch auf die Hälfte der runden Spermatiden begrenzt, obwohl diese Zellen durch Zellbrücken miteinander verbunden sind und ein Austausch von Genprodukten stattfinden kann. Außerdem ist das Responderprotein nur im Flagellum elongierter Spermien detektierbar, das heißt, die Translation findet erst in späten Spermatogenesestadien statt. Dies zeigt, dass translationelle Regulation in der Expression des Respondergens involviert ist und eine datenbankbasierte Analyse konnte bereits mögliche, regulatorische Elemente der translationellen Kontrolle in der 5’- untranslatierten Region (5’-UTR) des Respondertranskripts aufdecken. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene, responderbasierte Transgene kloniert, aus denen transgene Mäuse generiert wurden, um die Haploidspezifität der t-Komplex Responders in vivo auf Transkript- und Proteinebene durch in situ Hybridisierung und Immunhistochemie sowie funktionell in einem Vererbungstest zu untersuchen. Um die Bedeutung von regulatorischen Elementen der 5’-UTR für die Responderexpression zu klären, wurden unterschiedliche Deletionskonstrukte generiert und die Expressionsanalyse in vivo zeigte, dass die 5’-UTR tatsächlich in der Transkriptlokalisation involviert war. Sobald die selben 5’-UTR-Deletionen in Kombination mit der codierenden Region des Responders verwendet wurden, konnte gezeigt werden, dass die codierende Sequenz für die Transkriptstabilität und erfolgreiche Translation wichtig war, allerdings nur zusammen mit mindestens dem letzten Drittel der 5’-UTR. Schließlich konnte bei Untersuchungen der spezifischen Subdomänen innerhalb der codierenden Region des Responders durch Verwendung von Deletionskonstrukten in dieser Region verdeutlicht werden, dass eine erfolgreiche Translation des Gens von dem Vorhandensein der regulatorischen Subdomäne in der codierenden Sequenz abhängig war. Um das Ergebnis der Deletionsuntersuchungen auch funktionell zu bestätigen, wurden transgene Mäuse mit den Deletionen in der codierenden Region in einem Transmissionstest eingesetzt, bei dem die jeweilige Vererbungsrate des Transgens in Anwesenheit von Distortern erfasst wurde. Im Hinblick auf Transmission Ratio Distortion war dieser Vererbungstest nicht sehr aussagekräftig und damit nicht ausreichend, um zu beantworten, welche Responderuntereinheit allein ausreichende Responderaktivität hat. Zusätzlich offenbarte der Test, dass die gewählte Integrationsstrategie für Transgene möglicherweise Defizite aufweist. Zur Generierung von transgenen Mäusen wurde ein Rekombinase vermittelter Kassettenaustausch transgener Konstrukte als Einzelkopie in den ColA1 -Locus von embryonalen Stammzellen verwendet, aber der Integrationsort selbst zeigte im Verlauf dieser Arbeit jedoch unerwartete Positionseffekte, die zu niedriger oder komplett abwesender Expression der Transgene führten und die Ergebnisse der in situ Hybridisierung, der Immunhistochemie und des Transmissionstests beeinflussten. Das Vorhaben der Arbeit war die regulatorischen Elemente des Respondertranskripts zu identifizieren, die bedeutsam für die spezielle Expression diese Gens sind, um diese bei der Manipulation der Expression anderer Gene in der Maus oder anderen Spezies einsetzen zu können. Diese Arbeit konnte zeigen, dass die 5’-UTR des Respondergens in der Transkriptlokalisation involviert ist, während die codierende Region, allerdings nur in Kombination mit der 5’-UTR, die Transkriptstabilität und Translation kontrolliert. Somit verdeutlichen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die posttranskriptionelle Regulation des Responders sehr komplex ist und auf verschiedene regulatorische Elemente innerhalb des Transkripts angewiesen ist und dies erschwert eine mögliche Anwendung deutlich.

Non-Mendelian inheritance of the t-haplotype from heterozygous male mice to their offspring is also known as transmission ratio distortion. The t-haplotype, a variant form of the t-complex, spans nearly one third of mouse chromosome 17 and encodes several distorter genes and one responder gene, which lead to formation of two different sperm populations during spermatogenesis. Early expressed distorters activate signalling cascades of the sperm motility kinase, smok1, resulting in a negative effect on the motility of all sperm, while the responder counterbalances this situation only in sperm carrying the responder gene. This gives these so called t-sperm an advantage during fertilisation, and leads to an abnormally high inheritance. Previous work has demonstrated that a responder-based transgene shows haploid- specific transcript expression, which means that the mRNA is restricted to only half of all round spermatids, although these cells are connected via cellular bridges and thus exchange of gene products can occur. Furthermore, the responder protein is detectable only in the flagellum of elongated sperm, which means its translation takes place during late stages of spermatogenesis. This shows that translational regulation might be involved in responder gene expression and in silico analysis revealed already possible regulatory elements for translational control of the responder within the 5’-untranslated region (5’UTR) of the responder transcript. In the context of this work different responder-based transgenes were cloned to generate transgenic mice and to investigate the haploid specificity of the t-complex responder in vivo on transcript and protein level by using in situ hybridization and immunohistochemistry and functionally in a transmission ratio distortion test. In order to address the importance of regulatory elements of the 5’-UTR in responder expression several deletion constructs were generated and expression analyses in vivo revealed that the 5’-UTR was indeed involved in transcript localisation. When the same 5’-UTR deletions were examined in combination with the responder coding sequence, it was demonstrated that the coding region was necessary for transcript stability and successful translation, along with at least the last third of the 5’-UTR region. Additionally, analysis of specific subdomains within the coding region of the responder using deletion constructs within this region, revealed that successful translation of this gene was dependent on the presence of at least the regulatory subdomain in the coding sequence. In order to functionally verify observations from the deletion studies, transgenic mice harbouring the coding region deletions were used in a transmission ratio distortion test, which measured the rate of transgene inheritance in the presence of distorters. In terms of transmission ratio distortion this test was inconclusive, and was thus insufficient to answer the question of which responder subdomain has adequate responder activity. The test further revealed possible shortfalls in the transgene integration strategy chosen. A strategy using recombinase-mediated cassette exchange of transgenic constructs integrated as a single copy in the ColA1 locus was used to generate mice, but within this work the locus itself revealed some unexpected positional effects resulting in low or completely absent expression, thereby impacting the outcome of in situ hybridization analyses, immunohistochemistry, and of the transmission test. The intention of this work was to identify regulatory elements in the responder transcript which are important for the special expression of this gene and which might be used to manipulate other genes in the mouse or in other species. This work demonstrated that the 5’-UTR of the responder is involved in transcript localization while the coding region only in combination with the 5’-UTR is controlling transcript stability and translation. Therefore the results of this work revealed that post-transcriptional regulation of the responder is quite complex and depends on different regulatory elements within the transcript and this makes a possible application significantly difficult.