Der Einfluss der Oestrogenrezeptor-β-Isoformen, ERβ2 und ERβ5, auf die Proliferation und Tamoxifensensitivität des Mammakarzinoms, in vitro

Abstract

Das MaCa ist das verbreitetste Malignom unter Frauen weltweit. In mehr als 85% aller Fälle beruht die Erkrankung auf der Wirkung von Oestrogenen an ERs im Brustgewebe. Es gibt zwei ER-Typen: ERα und ERβ. Die Entdeckung des ERα führte zur Entwicklung des Tam, welches Oestrogene kompetitiv am ERα verdrängt. Seitdem findet Tam Anwendung in der adjuvanten Therapie des MaCa. Ein großes Problem ist dabei jedoch die Tam-Resistenz, die zur Progression und zum Rezidiv des MaCa führt. Bis heute wurden fünf ERβ-Isoformen identifiziert, von denen vor allem der ERβ1, der ERβ2 und der ERβ5 im Gewebe der Mamma exprimiert werden und deren Struktur auf unterschiedliche biologische Funktionen hinweist. Im Rahmen dieser in vitro Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass die Aktivierung des ERβ1 durch spezifische Agonisten die Proliferation von MaCa- Zellen signifikant hemmt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass diejenigen MaCa-Zelllinien, in denen eine ERβ1-Aktivierung antiproliferativ wirkt, auch sensitiv gegenüber Tam sind. In diesen Zelllinien wurde die Wirkung des Tams durch eine Agonisierung des ERβ1 mit dem spezifischen Liganden Geni signifikant verstärkt. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass die Aktivierung des ERβ1 durch Geni zur Resensitivierung gegenüber Tam in Tam- resistenten MaCa-Zellen führt. Als Ursache für diesen Effekt wurde die additive Wirkung einer ERα-Blockade durch Tam bei gleichzeitiger Agonisierung des ERβ1 identifiziert. Die spezifische Wirkung des Geni wurde mittels eines GFP-Reporter-Assays belegt. Dabei konnte gezeigt werden, dass dieser ERβ1-Agonist die Aktivität des ERα am ERE reduziert. In diesem Zusammenhang wurde auch die Rolle der Isoformen ERβ2 und ERβ5 untersucht. Mittels RT-PCR- und qRT-PCR-Analysen konnte gezeigt werden, dass die Inkubation mit Tam in MCF-7-Zellen zu einer Hochregulierung des ERβ5 und zu einer Herunterregulierung des ERβ2 führt, während Geni eine Hochregulierung des ERβ2 bewirkte. Dieser Mechanismus fehlte in den Tam-resistenten Zellen. Mittels stabiler Transfektion von Expressionsvektoren für ERβ2 bzw. ERβ5 in MCF-7-Zellen bzw. MTR-3-Zellen konnte nachgewiesen werden, dass die Überexpression beider Isoformen zu einer Hemmung führte. Darüber hinaus konnte vor allem für den ERβ5 eine signifikante Erhöhung der Sensitivität gegenüber Tam festgestellt werden. In den resistenten MTR-3-Zellen führte die Überexpression des ERβ5 zu einer Resensitivierung. Die Proliferationshemmende Wirkung von Tam konnte sowohl in den stabil transfizierten MCF-7- als auch in MTR-3-Zellen noch durch Geni verstärkt werden. Zur Aufklärung eines möglichen Wirkmechanismus wurde sowohl mit wt-MCF-7- bzw- wt-MTR3-Zellen sowie mit den ERβ2- und ERβ5-Transfektanten eine Zellzyklusanalyse mittels FACS durchgeführt. Diese zeigte, dass Tam in wt-MCF-7-Zellen eine Arretierung des Zellzyklus am G1-Restriktionspunkt verursacht, während Geni vor allem einen G2-Arrest bewirkte. In den ERβ2- und den ERβ5-überexprimierenden Zellen war hingegen eine deutlich stärkere Abnahme des S-Phasenanteils der Zellen zu verzeichnen. Die Kombination von Tam mit Geni führte zu einer stärkeren Abnahme des S-Phasenanteils als Tam bzw. Geni alleine. Damit konnte die additive Wirkung der beiden Substanzen auf der Ebene der Zellzyklusregulierung bestätigt werden. In den resistenten MTR-3-Zellen löste die Inkubation mit 4-OHT einen deutlichen Zellzyklusarrest aus, wenn diese den ERβ5 überexprimierten. Verstärkt wurde dieser Effekt noch durch die zusätzliche Behandlung mit Geni.

Breast cancer is the most common cancer observed in women. In 85% of these cases, the tumors are sensitive to estrogens and express so-called estrogen receptors (ERs). ERα is well established as a prognostic marker in breast cancer due to the beneficial effect of ERα-antagonist Tamoxifen (TAM) in adjuvant therapy. However, the roles of ERβ-isoforms remain less clear, especially in relation to TAM-resistance of breast cancer cells. In this study, the influence of ERβ-isoforms, notably ERβ2 and ERβ5, on cell- proliferation and TAM-sensitivity in human breast cancer cells was analysed. The expression of ERβ-isoforms in different breast cancer cell lines, including TAM-resistant cells (MTR-3), was examined by RT-PCR and Western- Blot-analysis. The effects of ERβ-activation on the proliferation of these cells were analyzed by MTT-assays after incubation with TAM, the ERβ-agonists Genistein, Diarylpropionitrile (DPN) or their combinations. In order to further characterize the roles of ERβ2 and ERβ5, the expression of ERβ2 and ERβ5 by RT-PCR and qRT-PCR were assessed in TAM-sensitive MCF-7 cells and MTR-3 cells, cultured with either ERβ-agonist or TAM. Secondly, MCF-7 and MTR-3 cells were stably transfected with ERβ2- or ERβ5-expression-vectors. The proliferation and sensitivity to TAM were analyzed in these genetically altered cells by MTT-assay. In order, to investigate the mechanisms, leading to the inhibition, a cell cycle-analysis was performed, using FACS. Activation of ERβ by Genistein and DPN inhibited the proliferation and increased the sensitivity to TAM only in ERα+/β+ cells (MCF-7; T47D) and dramatically re- sensitized MTR-3 cells to TAM. Slight proliferation was measured in ERα-/β+ cells (MDA-MB231; MDA-MB436) and no reaction was measured in Her-2 overexpressing cells (BT474; SKBR3). RT-PCR analysis revealed that ERβ2 and ERβ5 were differently regulated by TAM or Genistein in MCF-7 and MTR-3 cells. Moreover, overexpression of ERβ2 and ERβ5 increased the sensitivity of MCF-7 cells to TAM and, most interestingly, re-sensitized MTR-3 cells to TAM. Cell- cycle-analysis revealed an inhibitory effect of ERβ2 and ERβ5 on cell-cycle progression both in MCF-7- and MTR-3-cells.