Einfluss von Lysophosphatidsäure auf synaptische Transmission und Expressionsanalysen von Plasticity related gene 1 und LPA-Rezeptoren während der Gehirnentwicklung

Abstract

Die Bedeutung bioaktiver Phospholipide wie Lysophosphatidsäure (LPA) wurde in den letzten Jahren intensiv untersucht und zeigte einen essentiellen Einfluss dieser Substanz auf die Entwicklung des zentralen Nervensystems (ZNS). Der extra- und intrazelluläre Phospholipid-spiegel wird durch Enzyme reguliert, welche die Synthese- und Degradationsreaktionen dieser Moleküle katalysieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Plasticity related gene 1 (PRG1), ein Protein, das die hippocampale Erregbarkeit über die Regulation des LPA- Spiegels moduliert, untersucht. Parallel dazu wurden die LPA-bindenden Rezeptoren im Gehirn und differenzierten Neuronen analysiert und der Einfluss von LPA auf hippocampale Neurone in vitro untersucht. PRG1 wurde im Rahmen einer Suche nach neuen Proteinen, welche mit der Regeneration des ZNS assoziiert sind, entdeckt. Gegenstand der hier vorliegenden Arbeit waren weiterführende Untersuchungen zur Expression, Lokalisation und potentieller Funktion von PRG1. Untersuchungen mittels quantitativen Real-Time-PCR zeigten, dass die Expression von PRG1 im Hippocampus und Neocortex entwicklungsabhängig reguliert ist und das maximale mRNA-Niveau zum Zeitpunkt der Synaptogenese erreicht. Detaillierte subzelluläre Analysen an hippocampalen Neuronen in vitro ermöglichten einen Einblick in die Lokalisation von PRG1 während der zellulären Ausdifferenzierung. Es konnte in vorliegender Arbeit gezeigt werden, dass das PRG1 in jungen Neuronen eine homogene Verteilung in der Plasmamembran aufweist und sowohl in Lamellipodien als auch in Filopodien der Neurite vorhanden ist. In späteren Reifestadien konnte eine spezifische Lokalisation im Dendritenschaft beobachtet werden. Besonders intensiv wurde das PRG1 in Spines der ausgereiften Neuronen vorgefunden. Aufgrund der im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Daten kann angenommen werden, dass PRG1 während neuronaler Entwicklung in die Prozesse der Synapto- und Spinogenese involviert sein könnte. In vitro-Untersuchungen lassen auf eine mögliche Beteiligung von PRG1 an Stabilisierung, Konsolidierung oder Wegfindung der Neuriten schließen. Als Membranprotein könnte PRG1 auf extrinsische Faktoren, wie z. B. LPA reagieren und Signale intrazellulär weiterleiten. In weiteren Untersuchungen während dieser Arbeit wurden Rezeptoren analysiert, welche LPA als spezifischen Liganden binden. Gegenwärtig sind fünf LPA-Rezeptoren bekannt. Die LPA-Rezeptoren gehören zu der Klasse der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und regulieren vielseitige intrazelluläre Prozesse nach ihrer Aktivierung. In dieser Arbeit wurde mit der sensitiven und quantitativen Real- Time-PCR zum ersten Mal gezeigt, dass LPA3- und LPA5-Rezeptoren im Gehirn nicht exprimiert werden. Aufgrund ähnlicher oder identischer intrazellulärer Signalkaskaden ist bis heute noch nicht klar, welche Rolle jedem einzelnen Rezeptor zukommt. Detaillierte Analysen der LPA-Rezeptor Expression während der neuronalen Entwicklung zeigten, dass die LPA1- und LPA2-Rezeptoren eine Dominanz in primären hippocampalen Neuronen aufweisen. Funktionsanalysen an primären hippocampalen Neuronen in vitro zeigten ferner, dass LPA einen Anstieg der intrazellulären Calciumtransienten auslöst. Zum ersten Mal wurde demonstriert, dass dieser Effekt allein auf den LPA2-Rezeptor zurückzuführen ist. Weiter-hin geht dieser Effekt mit der Exozytose synaptischer Vesikel einher und beschränkt sich aus-schließlich auf die glutamaterge Transmission. In dieser Arbeit konnte somit erstmalig präsentiert werden, dass LPA die exzitatorische Transmission, spezifisch über den LPA2-Rezeptor, reguliert. Die im Rahmen dieser Arbeit generierten Daten sind ein Beitrag zum Verständnis der Funktionen von PRG1, LPA und LPA-Rezeptoren im ZNS.

Extensive research into the role of bioactive phospholipids such as lysophosphatidic acid (LPA) over recent years has shown them to be essential in the development of the central nervous system (CNS). Extra- and intracellular phospholipid levels are regulated by enzymes that catalyze the synthesis and degradation reactions of lysophospholipids. This study examined plasticity-related gene 1 (PRG1), a protein that mediates hippocampal excitability by regulating LPA levels and which was discovered as part of a search for new proteins involved in regeneration of the CNS. An additional focus was the analysis of LPA-binding receptors in the brain and differenti- ated neurons, and the effect of LPA on primary neurons in vitro. Investigation by means of quantitative Real-time PCR showed that the expression of PRG1 in the hippocampus and neocortex is dependent on development and reaches maximum mRNA levels at the time of the synaptogenesis. Cellular analyses of primary hippocampal neurons in vitro showed the localization of PRG1 during cellular maturation. PRG1 was found to display homogeneous distribution in the plasma membrane of young neurons and exist in lamellipodia and filopodia of the neurites. At later maturation stages, specific localization was observed in the dendrites. PRG1 was found at especially high levels in spines of mature neurons. This data suggests that PRG1 could be involved in synapto- and spinogenesis during neural development. In vitro investigation also indicates that PRG1 could participate in stabilisation, consolidation and pathfinding of the neurites. As a membrane protein, PRG1 possibly reacts to extrinsic factors such LPA and passes these signals on into the cell. In additional experiments, receptors that bind LPA as a specific ligand were analyzed. Five LPA receptors have been identified to date. They belong to the G protein-coupled receptor class and regulate a great number of cellular processes. In this part of the study, quantitative Real-time PCR demonstrated for the first time that the LPA3 and LPA5 receptors are not expressed in the brain. Due to the fact that the cellular signal cascades of these receptors are in some cases identical, their individual roles are as yet unclear. Detailed analyses of LPA receptor expression during neural development showed that the LPA1 and LPA2 receptors dominate in primary hippocampal neurons. Further, functional analyses on hippocampal neurons in vitro showed that LPA leads to an increase in intracellular calcium. This effect was traced back to the LPA2 receptor. Furthermore, the experiments demonstrated that LPA-induced calcium increase modulates the exocytosis of synaptic vesicles and is limited to glutamatergic transmission. This work shows that LPA regulates excitatory transmission specifically through activation of the LPA2 receptor in primary hippocampal neurons. The data generated within this work contribute to the understanding of the functions of PRG1, LPA and LPA receptors in the CNS.