Potenzierung der Neurotoxizität des Status epilepticus durch Antikonvulsiva im Pilocarpin-Modell der neugeborenen Ratte

Abstract

Epileptische Anfälle sind häufige neurologische Störungen des Kindesalters. Sie können als epileptische Einzelanfälle oder rezidivierend im Sinne einer Epilepsie auftreten. Der epileptische Anfall bewirkt die massive Freisetzung von Glutamat und die Dauerstimulation von Neuronen. Seine neurotoxische Wirkung besteht in einer Störung der zellulären Homöostase mit Anstieg des intrazellulären Kalziums und kann eine passive exzitotoxische sowie eine aktive apoptotische Komponente aufweisen. Die Epilepsie erfordert eine Therapie mit Antikonvulsiva, die über verschiedene Mechanismen die Aktivität exzitatorischer und inhibitorischer Neurotransmitter modulieren. Sowohl die Unterstimulation von NMDA-Glutamatrezeptoren, als auch die Wirkungsverstärkung von GABA können Apoptose im unreifen Gehirn bewirken. In dieser Arbeit ist untersucht worden, ob ein Pilocarpin-induzierter Status epilepticus im unreifen Rattenhirn zu einer verstärkten Neurodegeneration führt, welchen morphologischen Charakter diese Degeneration trägt, und in welcher Weise sie durch die zusätzliche Gabe des Benzodiazepins Diazepam beeinflusst wird. Dazu wurde 7-Tage alten Wistar-Ratten intraperitoneal Pilocarpin (200mg/kg), Diazepam (5mg/kg), Pilocarpin (200mg/kg) und im Intervall von 2 Stunden nach Auslösung eines Status epilepticus Diazepam (5mg/kg), sowie der Kontrollgruppe Aqua-Injektionslösung injiziert. Die Tiere wurden 3, 4, 6, 12 and 24 Stunden nach Injektion der Testsubstanz getötet. Es erfolgte die histologische (DeOlmos Silberfärbung) und morphologische (Elektronenmikroskopie) Aufarbeitung von Hirnschnitten. Mittels Western Blot wurde untersucht, ob die mit dem Status epilepticus assoziierten histologischen und morphologischen Veränderungen auf Proteinebene mit einer Beeinflussung der antiapoptotischen PI3K- und ERK1/2-Kaskade einhergehen, und wie dieser Effekt durch Diazepam modifiziert wird. Es konnte gezeigt werden, dass 24 Stunden nach einem Status epilepticus die Anzahl degenerierter Neurone im Gehirn der neugeborenen Ratte erhöht ist, und die zelluläre Degeneration morphologische Kriterien des exzitotoxischen und apoptotischen Zelltodes aufweist. Die Neurodegeneration wird potenziert, wenn im Anschluss an den Status epilepticus Diazepam verabreicht wird, während Diazepam allein keine Degeneration auslöst. Auf Proteinebene findet sich 4 Stunden nach Beginn des Status epilepticus ein deutlicher Anstieg der aktivierten Formen der antiapoptotischen Kinasen Akt, Raf-1 und ERK1/2. Diazepam bewirkt eine Unterregulation dieser antiapoptotischen Faktoren. In der Kombination beider Testsubstanzen zeigt sich, dass Diazepam den Status epilepticus-induzierten Kinaseanstieg mindert. Aus den Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass GABA-Mimetika die Regulation antiapoptotischer Kaskaden während eines Status epilepticus ungünstig beeinflussen und den neurotoxischen Effekt des Krampfanfalls im unreifen Gehirn der Ratte potenzieren. Ihre Verwendung beim Kleinkind sollte unter strenger Beachtung der medizinischen Indikation erfolgen.

Seizures are most common in young children, they may may occur as occasional seizures or be manifestation of epilepsy. During epileptic discharges high levels of glutamate are released by excessively stimulated neurons and may cause neuronal damage due to disturbances of homeostasis and increase of intracellular calcium levels. Both, passive excitotoxic and active apoptotic forms of neuronal death may occur. Epilepsies are characterized by recurrent seizures. They are treated by antiepileptic drugs which modify the activity of excitatory and inhibitory neurotransmitters and/or ion channels. Either pharmacologic inhibition of NMDA-glutamate-receptors or stimulation of GABA- receptors may lead to apoptotic neuronal death in the immature brain. In this study we investigated whether pilocarpine-induced status epilepticus leads to neurodegeneration and examined its morphological features and modulation by diazepam. Seven day old Wistar-rats were intraperitonally injected with pilocarpine (200mg/kg), diazepam (5mg/kg), pilocarpine (5mg/kg) followed by diazepam 2 hours after initiation of status epilepticus, or vehicle. Animals were killed 3, 4, 6, 12 and 24 hours after the injection of the compounds. Subsequently, brains were analyzed histologically (DeOlmos silver staining and electron microscopy). By Western Blot analysis we further investigated whether status epilepticus-associated histological and morphological changes were accompanied by regulation of antiapoptotic PI3K- and ERK1/2-pathways and if so, whether this regulation was modified by diazepam. We found that neurodegeneration in the immature rat brain is increased 24 hours after pilocarpine-injection and that this neurodegeneration has morphological features consistent with apoptotic and excitotoxic death. Additional application of diazepam potentiates apoptotic neurodegeneration, although diazepam alone does not trigger neurodegeneration. Four hours after the initiation of status epilepticus an increased activity of antiapoptotic kinases Akt, Raf-1 and ERK1/2 was shown. Diazepam decreases the activity of these protein-kinases. Diazepam given 2 hours after the initiation of status epilepticus compromises activation of antiapoptotic pathways by status epilepticus. It may be concluded that GABA-mimetics potentiate the neurotoxic effect of status epilepticus in the immature rat brain. Therefore, GABA- mimetic drugs should cautiously be used in young children.