Molekulare Mechanismen der transkriptionellen Regulation des Renin-Gens

Abstract

Das Renin-Angiotensin-System (RAAS) spielt für die Langzeit- Blutdruckregulation und die Steuerung des Wasser-Elektrolyt-Haushaltes im menschlichen Körper eine herausragende Rolle, der seit Entwicklung der ACE- Hemmer und des Renin-Inhibitors Aliskiren auch von klinisch-therapeutischer Seite Rechnung getragen wird. In diesem Zusammenhang ist besonders auch die Regulation der Renin-Freisetzung und der Renin-Synthese auf Transkriptions- und posttranskriptioneller Ebene von großem Interesse. Auf Transkriptionsebene haben bisherige Forschungsarbeiten dabei insbesondere die Funktion der Promotorregion, eines distalen Enhancers (renaler Enhancer bei ca. -11kbp stromaufwärts des humanen Renin-Gens) und eines proximalen Enhancers (Chorion- Enhancer bei ca. -5,5kbp) beleuchtet. Ein Einfluss auf diese Regionen konnte für zahlreiche trans-Faktoren festgestellt werden, darunter CREB (cAMP- Responsive-Element-Binding-Protein), HOX, LXRα/β, PPARγ, RXR, VDR (Vit.D-Rezeptor) und WT1 (Wilms-Tumor-Suppressor). Bislang wenig experimentelle Evidenz besteht hingegen für den distalen Teil einer bei -11kbp bis -14kbp gelegenen, evolutionär konservierten Region (hRENc-Region), deren proximaler Teil den renalen Enhancer umfasst. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte die Rolle eines nicht-codierenden, ca. 720bp umfassenden DNA- Abschnittes innerhalb der hRENc-Region bei ca. -13kbp (PCT3-Region) untersucht werden, dessen distal gelegener Anteil (Teilabschnitte PCT3A bei -13341bp bis -13167bp und PCT3B bei -13186bp bis -12987bp) ein hohes Maß an evolutionärer Konserviertheit aufweist. Dazu wurden Reportervektoren generiert, die stromaufwärts des Luciferase-Gens den minimalen Renin-Promotor und, diesem vorgeschaltet, die PCT3-Region oder je ca. 200bp umfassende Teilfragmente der Region (PCT3A-D) enthielten. Die Vektoren wurden in HEK293-Zellen transfiziert und die Luciferase-Aktivität unter verschiedenen Stimulationsbedingungen gemessen (unbehandeltes Medium, Ethanol, Forskolin, Angiotensin II, Phorbolester, TNFα). Ohne Stimulation zeigten die PCT3-Fragmente einen 1,3-fachen bis 3,3-fachen aktivierenden Einfluss auf den Renin-Promotor (PCT3A>PCT3>PCT3B>PCT3D, kein Effekt von PCT3C), der sich vor allem durch Zugabe von TNFα (c=10µmol/l) modulieren ließ (Aufhebung der aktivierenden Effekte, inhibitorischer Effekt für PCT3B, C und D). Deletionen von je ca. 20bp umfassenden Abschnitten des PCT3A-Elementes ergaben für alle Deletionskonstrukte eine Abschwächung des aktivierenden Effektes gegenüber PCT3A. Die Ergebnisse sprechen für das Vorliegen eines komplexen regulatorischen Elementes, in dem ein aktivierender Effekt des gesamten PCT3A- Fragmentes auf den Renin-Promotor durch die Fragmente PCT3B, C und D abgeschwächt wird, die isoliert keinen inhibitorischen Einfluss zeigen. Um die Funktionsweise der PCT3-Region und den Mechanismus der Wirkung von TNFα in diesem Abschnitt näher auszuleuchten, müssten noch weitere Experimente durchgeführt werden, darunter Reporterassays mit multiplen Kombinationen der PCT3-Teilabschnitte, Gelshift- und CHIP-Assays. Aufschluss über die Funktion des PCT3-Elementes in vivo und im Kontext mit dem renalen und dem Chorion- Enhancer könnten aus murinen transgenen oder Knock-out-Modellen gewonnen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss des Fettsäure-abhängigen nukleären Rezeptors HNF4 auf regulatorische cis-Elemente des Renin-Gens untersucht, für den potentielle Bindungsstellen im PCT3B-Element und in den -5797bp unmittelbar stromaufwärts des Exon1 identifiziert werden konnten. Hier zeigte sich im Luciferase-Reporterassay eine 3,7-fache Aktivierung des PCT3B- Vektors sowie eine 6-fache Aktivierung eines -5797bp-Reportervektors unter HNF4-Überexpression. Diese Effekte konnten durch die Deletion einer HNF4-Bindungsstelle bei -13102bp bis -13082bp im PCT3B-Element, nicht jedoch durch Mutation von drei potentiellen Bindungsstellen im -5797bp-Element abgeschwächt werden. Ein Einfluss von HNF4 auf die Renin-Transkription, der noch durch Messungen von nativem Renin auf mRNA- und Protein-Ebene sowie ggf. in vivo bestätigt werden sollte, könnte weitere Erkenntnisse über die Funktion des PCT3B-Elementes und die Steuerung des proximal tubulären RAAS durch metabolische Faktoren wie die Fettsäuren bringen, da im proximalen Tubulus HNF4 in großer Menge und Renin co-exprimiert werden. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss der polyungesättigten Omega3-Fettsäure Eicosapentaensäure (EPA, 20:5n3) auf die Renin-Expression untersucht. Hier zeigten murine isolierte JG-Zellen in Kultur nach Behandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen EPA einen bis zu 0,24-fach verringerten Gehalt an Renin-mRNA (c(EPA)=100µM). Um den zugrunde liegenden Mechanismus über fettsäureabhängige Transkriptionsfaktoren oder den Prostaglandinstoffwechsel aufzuklären und die mögliche Rolle des Effektes im Rahmen der blutdrucksenkenden Wirkung von Omega3-Fettsäuren auszuleuchten, bedürfte es auch hier noch weiterer Untersuchungen.

The renin-angiotensin system (RAAS) plays a prominent role in long-term blood pressure regulation and control of the water-electrolyte homeostasis in the human body. In this regard, the regulation of renin release and renin synthesis is of great interest. Previous research on renin transcription, in particular, has illuminated the function of the promoter region, of a distal enhancer (renal enhancer at approximately -11kbp upstream of the human renin gene) and of a proximal enhancer (chorionic enhancer at approximately -5.5 kbp). An impact on these regions was observed for different trans-factors, including CREB, HOX, LXRalpha/beta, PPARgamma, RXR, VDR and WT1 (Wilms tumor suppressor). Little experimental evidence exists, however, for the distal part of an evolutionarily conserved region (hRENc region) between -11kbp and -14kbp, comprising the renal enhancer in its proximal portion. In the first part of this study, the role of a non-coding DNA segment within the hRENc region at approximately -13kbp (PCT3 region) should be analysed, which has a high degree of evolutionary conservation in its distal portion (segment PCT3A between -13341bp and -13167bp, segment PCT3B between -13186bp and -12987bp). For this purpose, reporter vectors have been generated, containing the minimal renin promoter and the PCT3 region or 200bp partial fragments of the region (PCT3A-D) upstream of the luciferase gene, respectively. The vectors were transfected into HEK293 cells and luciferase activity was measured under different stimulation conditions (untreated medium, ethanol, forskolin, angiotensin II, phorbol ester, TNFalpha). Without further stimulation, the PCT3 fragments showed a 1.3-fold to 3.3-fold enhancing effect on the renin promoter (PCT3A> PCT3> PCT3B> PCT3D, no effect of PCT3C). This effect could be modulated mainly by the addition of TNFalpha at a concentration of 10μmol / l (abolition of all enhancing effects, inhibitory effect for PCT3B, C and D). The activating effect of PCT3A on the renin promoter decreased after deletion of 20bp fragments, respectively. These results suggest the presence of a complex regulatory element. An enhancing effect of the entire PCT3A fragment on the renin promoter is attenuated by the fragments PCT3B, C and D, which do not show an inhibitory effect on their own. To illuminate the function of the PCT3 region and the impact of TNFalpha in more detail, further experiments would have to be carried out, including reporter assays with multiple combinations of the PCT3 sub-sections, gel shift and CHIP assays. Information about the function of the PCT3 element in vivo could be derived from murine transgenic or knock-out models. In the second part of the study, the influence of the fatty acid-dependent nuclear receptor HNF4 on regulatory cis-elements of the renin gene was analysed. Potential binding sites for HNF4 were identified in the PCT3B element and in the -5797bp upstream of exon 1 of the renin gene. In luciferase reporter assays, a 3.7-fold activation of the PCT3B vector and a 6-fold activation of a -5797bp reporter vector could be seen under HNF4 overexpression. These effects were attenuated by deletion of a HNF4 binding site in the PCT3B element between -13102bp and -13082bp, but not by mutation of three potential binding sites in the -5797bp element. The effect of HNF4 on renin transcription should be confirmed by measurements of renin mRNA and protein levels and in vivo. These experiments could then provide further insight into the function of the PCT3B element and into the control of a proximal tubular RAAS by fatty acids, as in the proximal tubule of human kidney HNF4 in great abundance and renin are co-expressed. In the third part of the study, the influence of the polyunsaturated omega-3 fatty acid eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5 n3) on renin expression should be investigated. Murine isolated JG cells in culture were treated with various concentrations of EPA and showed a 0.24-fold reduced level of renin mRNA at an EPA concentration of 100μM. Further investigation would be required to elucidate the underlying mechanism via fatty acid-dependent transcription factors or the prostaglandin metabolism and to clarify a possible role of these results in the anti-hypertensive effect of omega-3 fatty acids.