Untersuchungen zur Funktion von Pipsqueak und Piefke, zwei Pipsqueak-Domänen- Proteine von Drosophila melanogaster

Abstract

Pipsqueak und GAGA-Faktor Der Drosophila GAGA-Faktor (GAF) wurde mit verschiedenen, teilweise gegensätzlichen Funktionen in Verbindung gebracht. GAF scheint nicht nur an der Regulation der Expression einzelner Gene beteiligt zu sein, sondern hat auch Funktionen bei der Organisation übergeordneter chromosomaler Strukturen. So hat GAF Funktionen bei der transkriptionellen Aktivierung und dem Silencing von Genen, blockiert Enhancer und wird bei der Kondensierung und Trennung der Chromosomen bei der Mitose benötigt. Insbesondere spielt GAF eine Rolle bei der Erhaltung eines aktivierten und reprimierten Zustands homöotischer Gene, hat also sowohl Eigenschaften von TrxG- als auch von PcG-Proteinen. Diese vielseitigen Funktionen scheint GAF durch Veränderungen der Chromatinstruktur, durch chromatin remodeling, auszuüben. GA-reiche DNA-Elemente, an die GAF bindet, vermitteln die Effekte von GAF. Diese Sequenzen können auch von einem zweiten Drosophila-Protein, Pipsqueak, erkannt und gebunden werden. Ergebnisse dieser Arbeit belegen, daß beide Proteine zusammen als Partner agieren. So sind beide Proteine an polytänen Chromosomen kolokalisiert. Beide Proteine finden sich in einem gemeinsamen Proteinkomplex und binden außerdem direkt über ihre jeweilige BTB/POZ-Domänen aneinander. Diese Daten wurden zusammengefaßt, und daraus wurde in dieser Arbeit ein Modell entwickelt (Abb. 27), das erklärt, wie Psq und GAF kooperativ als möglicherweise obligatorische Partner an der Kontrolle einer Vielzahl von Genen beteiligt sein könnten. Ergebnisse genetischer Interaktionsstudien zeigen, daß Psq zusammen mit GAF auch an der Regulation, der Aktivierung und dem Silencing homöotischer Gene beteiligt ist. Psq hat also ebenfalls sowohl Eigenschaften von TrxG- als auch von PcG- Proteinen. Darüber hinaus sind Psq und GAF auch an mitotischen Chromosomen vollständig kolokalisiert. Dies deutet darauf hin, daß Psq auch übergeordnete Funktionen chromosomaler Organisation übernehmen und an mitotischen Prozessen beteiligt sein könnte. Diese Vermutung wird dadurch gestützt, daß psq hier als Enhancer der PEV identifiziert wurde, woraus geschlossen werden konnte, daß Psq, wie auch GAF, an der Etablierung von Heterochromatin beteiligt ist. Die hier vorgestellten genetischen, biochemischen und zytogenetischen Daten belegen, daß Psq und GAF als Partner kooperativ an der Kontrolle homöotischer und vieler anderer Gene mitwirken. Zukünftige Studien zur GAF-Funktion müssen deshalb Psq als neuen Partner mit einbeziehen. Dies könnte neue Erkenntnisse über den Wirkungsmechanismus dieses wichtigen Chromatinfaktors erbringen. Piefke In dieser Arbeit ist es gelungen, die Charakterisierung eines weiteren Mitglieds der Psq-Proteinfamilie zu beginnen. Durch Datenbankanalysen konnte piefke als ein neues Gen identifiziert werden, das ein Protein mit einer Psq- und einer BTB/POZ-Domäne kodiert. Das Gen wurde kloniert und ein rekombinantes Protein bakteriell exprimiert und gereinigt. Damit wurden polyklonale Antikörper generiert. Diese Antikörper wurden dazu genutzt, die Expression von Pfk näher zu untersuchen. Pfk ist ein kernlokalisiertes Protein, das in Ovarien und in Speicheldrüsen exprimiert wird. Außerdem ist Pfk an polytänen Chromosomen lokalisiert. Ob das Protein dabei über die Psq-Domäne direkt an DNA bindet, oder lediglich chromatinassoziiert vorliegt, wurde nicht geklärt. Pfk scheint, wenn überhaupt, nur an wenigen Loci mit Psq/GAF-Komplexen an polytänen Chromosomen kolokalisiert zu sein. Eine partielle Kolokalisierung von Pfk mit HP1 konnte nachgewiesen werden. Diese Kolokalisierung von Pfk und HP1 umfaßt nicht nur heterochromatische chromozentrische Bereiche, sondern auch euchromatische Regionen. Diese Lokalisationsstudien ergeben erste Hinweise auf mögliche Funktionen von Pfk bei der Organisation von Chromatinstrukturen. Weiterführende Experimente werden vor allem die Identifizierung von Proteinen umfassen, die mit Pfk interagieren. Auch wird es wichtig sein, die DNA-Sequenz, an die Pfk bindet, zu identifizieren. Besondere Bedeutung kommt insbesondere der Identifizierung und Charakterisierung von pfk-Mutanten zu, um funktionelle Daten zu Pfk zu erlangen.

Pipsqueak and GAGA-Factor The Drosophila GAGA-factor (GAF) has been implicated with diverse and partially contrary functions. GAF has initially been identified as a classical transcription factor because it stimulates transcription of many known genes. But soon GAF was suspected to function in organizing higher order chromatin structure. There are reports that GAF can activate transcription, that it can silence genes, that it can block enhancers and that it may play a role in chromosome condensation and segregation during mitosis. GAF plays a role in maintaining an active and a repressed state of homeotic gene expression. This points to a role of GAF in both trxG and PcG mediated gene regulation. It is suspected that GAF acts through a chromatin remodeling mechanism mediating its diverse functions. GAF binds to GA-rich elements mediating the functions GAF has been implicated with. It has recently been observed that these GAGA DNA elements can be bound by a second Drosophila protein, encoded by the pipsqueak (psq) gene. The data presented here suggest that both proteins, Psq and GAF, act in concert as partners. The binding patterns of Psq and GAF on polytene chromosomes are identical. Psq and GAF are associated in a protein complex and they directly bind to one another through their BTB domains. Taken together, these data are consistent with a new model presented here (Fig. 27). This model explains how GAF and Psq might cooperate as obligatory partners in the transcriptional control of many genes. Genetic interaction studies demonstrate that psq and Trl have similar functions. Psq and GAF act together in the transcriptional activation and silencing of homeotic genes. Thus, GAF and Psq have properties of trxG- and PcG-proteins. As on polytene chromosomes, the binding patterns of Psq and GAF on mitotic chromosomes also show a complete overlap. These results suggest that Psq and GAF share common functions not only in the control of target genes at euchromatic sites, but also in heterochromatin organization and mitosis. This hypothesis was further supported by the finding that psq acts, like Trl, as an enhancer of position effect variegation suggesting a role of Psq in establishing heterochromatin structures. The genetic, biochemical, and cytogenetic data presented here strongly suggest that Psq and GAF act together as partners in the control of homeotic and many other genes. Future studies on GAF function will therefore have to include this partner, and may thus provide novel insights into the mechanism of action of this important chromatin factor. Piefke Here, we have set out to characterize a new member of the Psq family. By searching the Drosophila genome we have identified a new gene, piefke (pfk), encoding a Psq-domain protein. Additionally, Piekfe (Pfk) contains a BTB/POZ domain. The gene has been cloned and a recombinant protein was expressed in bacteria. The protein was purified and used to generate polyclonal antibodies. Using these antibodies we analyzed the expression of Pfk. Pfk is a nuclear protein present in larval salivary glands and in ovaries. Immunostaining of polytene chromosomes shows that Pfk binds to chromosomal loci. Pfk is indeed a chromatin component. It was not tested if the protein binds directly to the DNA via the Psq-domain or if it is just chromatin associated. Pfk shows only limited colocalization with Psq/GAF- complexes on polytene chromosomes. A partial colocalization of Pfk and HP1 has been observed. This colocalization includes not only heterochromatic regions but also euchromatic loci. The localization studies presented here give a first hint on possible functions of Pfk in organizing chromatin structures. Future experiments are directed towards the identification of interacting proteins of Pfk. It will also be important to identify target sequences and genes of Pfk. Future experiments will especially have to include the determination of the biological functions of Pfk by identifying and characterizing pfk mutants.