Untersuchungen zum molekularen Aufbau von Zell-Zell-Kontakten und zur differentiellen Expression von Endothelzellproteinen nach Hypoxie zur Aufklärung von Pathomechanismen an der Blut-Hirn-Schranke

Abstract

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) stellt eine funktionelle Einheit dar, die zum einen die optimale Versorgung des Gehirns mit Nährstoffen sicherstellt, andererseits das Gehirn u.a. durch dichte interzelluläre Verbindungen (z.B. tight junction) vor potentiell schädlichen Inhaltsstoffen des Blutes schützt. Pathologische Prozesse, wie z.B. Ischämie (Hypoxie), können die Funktionstüchtigkeit der BHS beeinträchtigen und somit eine Schädigung des Hirngewebes begünstigen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Ansätze aus der Proteomforschung verfolgt. Ein Schwerpunkt war die Untersuchung der differentiellen Proteinexpression in Gehirnkapil-larendothelzellen nach 24 Stunden Hypoxie. Die im Rahmen dieser Fragestellung entwickelte Kombination von trägerfreier isoelektrischer Fokussierung (Rotofor / SDS-PAGE) mit stable isotopic labeling with amino acids in cell culture (SILAC) ermöglichte die Identifizierung und Quantifizierung der relativen Konzentration von sowohl niedrig exprimierten als auch lipophilen Proteinen. Unter den nach 24 Stunden Hypoxie erhöht exprimiert identifizierten Proteinen sind solche, die in die anaerobe Glycolyse, Redoxprozesse, sowie Proteinbiosynthese und –faltung involviert sind, aber auch Struktur- und Hitzeschockproteine. Einige Proteine (Farnesylpyrophosphatsynthetase, Ribosomenbindendes Protein 1, EMILIN 1, Oligosaccharyltransferase) sind in der Literatur noch nicht im Zusammenhang mit Hypoxie beschrieben. Zur Untersuchung der molekularen Umgebung von tight junction wurde die Cholesterolabhängigkeit von tight junction Proteinen mithilfe von Cholesterolentzug durch Methyl-beta-Cyclodextrin (MbCD) in normalen Rattencholangiocyten analysiert. Mit Immunfluoreszenz wurde eindeutig eine Cholesterolabhängigkeit der Lokalisation für Occludin, Claudin-1, -3, -4 und -7 in NRC nachgewiesen. Nach Cholesterolentzug mit MbCD wurden an einer Präparation von membrane rafts mittels SILAC quantitative Daten für Claudin-4 und -7 erhoben und so ein weiterer Hinweis für eine cholesterolabhängige Lokalisation von tight junction Proteinen erhalten. Zur funktionellen Proteomanalyse der am tight junction-Komplex beteiligten Proteine wurden drei Präparationen zur Anreicherung von tight junction durchgeführt, die im Wesentlichen die Extraktion detergens-unlöslicher Fraktionen aus Rattenleber darstellen. Die Extrakte wurden elektrophoretisch aufgetrennt (SDS-PAGE) und vollständig massenspektrometrisch analysiert. Neben bekannten tight junction Proteinen wurden auch solche identifiziert, die bisher in der Literatur nicht in Verbindung mit tight junction erwähnt wurden, für die aber nach Datenlage eine Beteiligung an diesem Komplex als möglich erscheint.

The blood brain barrier (bbb) ensures the optimal maintenance of nutrients in brain and protects it against potentially toxic substances in blood by tight intercellular junctions (e.g., tight junctions). Pathological processes, such as ischemia (hypoxia) can lead to disturbances in the integrity of bbb and promote further impairment of brain. In this work proteomic methods were used. The first part is aimed at analysing alterations in the protein expression of rat brain capillary endothelial cells cultured under hypoxic conditions for 24 hours. For this purpose, a modified two-dimensional electrophoresis technique was established which combines isoelectric focusing in the liquid phase (Rotofor) and SDS-PAGE with stable isotopic labeling by amino acids in cell culture (SILAC). This procedure enabled identification and quantification of low abundant and lipophilic proteins. In addition to general stress response, functions of proteins found up-regulated after 24 h hypoxia are related to glycolysis, redox activities, protein biosyntheses and –folding or cell structure. Some of the proteins (e.g., farnesyl pyrophosphate synthetase, ribosome binding protein 1, EMILIN 1, oligosaccharyl transferase) were not described in the context of hypoxia in literature so far. Two approaches were applied for studies concerning the molecular environment of tight junction. The determination of cholesterol dependence on localisation of tight junction proteins was accomplished by cholesterol depletion using methyl beta cyclodextrin (MbCD) in normal rat cholangiocytes (NRC). The localisation of occludin, claudin-1, -3, -4, and -7 in NRC was found to depend on the presence of cholesterol. Cholesterol depletion by MbCD also enabled SILAC-based mass spectrometric quantification of claudin-4 and -7 in a membrane raft preparation obtained from NRC. Special emphasis was put on the proteomic analysis of tight junctions and proteins associated to the junctional complex. Three tight junction enriching preparations were analysed, basically consisting of detergent resistant membrane fractions from rat liver. The extracts were separated by gel electrophoresis (SDS-PAGE) and the entity of proteins was identified by mass spectrometry.