Nanopartikel als Verstärkungsstrategie in fluoreszenzbasierten Immunoassays

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von fluoreszenten Farbstoffnanopartikeln, welche als Label in einem Immunoassay eingesetzt werden und die Signalintensität und Sensitivität des Assays steigern sollten. Dafür wurden systematische Verkapselungsstrategien für verschiedene neutrale und ionische/ geladene Farbstoffe untersucht und systematische Untersuchungen zu Einflussgrößen wie Nanopartikelgröße, Biokonjugation und Farbstoffbeladungskonzentration durchgeführt. Es wurden zwei unterschiedliche Partikelsysteme hergestellt und in Bezug auf ihre reproduzierbare Herstellung und spätere Eignung für den Einsatz als Nanopartikellabel in Immunoassays systematisch untersucht. Dabei stellten sich aufgrund ihrer Stabilität, ihrer einfachen und reproduzierbaren Herstellung, ihrer engen und definierten Größenverteilung, ihrer ausreichend funktionellen Oberflächengruppen und durch die Möglichkeit die Farbstoffmenge im NP präzise einzustellen, farbstoffbeladene Polystyrolpartikel als besonders geeignet heraus. Für die Anbindung von SAv an amino- und carboxyfunktionalisierte Polystyrolnanopartikel wurden zwei verschiedene Kopplungssmethoden, die Anbindung über EDC/ sulfo-NHS und über einen heterobifunktionellen PEG-Linker, getestet. Beide Kopplungsstrategien sind geeignet, um Streptavidin an die Partikeloberfläche zu binden unter Vermeidung von NP-Aggregation. Die Mengen an partikelgebundenem SAv wurden mit Hilfe des BCA- und Biotin-FITC-Assays bestimmt. Da beide Assays vorrangig für die Quantifizierung von Proteinen in Lösung entwickelt wurden, mussten beide Assays erst auf mögliche Wechselwirkungen mit Farbstoffen und der Partikelmatrix sowie Störeinflüsse durch die Partikelstreuung und spektrale Interferenzen mit den Kodierungsfarbstoffen untersucht werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass einige Farbstoffe den Kupfer(II)-BCA-Komplex reduzieren und es folglich zu einer Überbestimmung von Streptavidin kommt. Weiterhin konnten Farbstoffe wie meso-Tetraphenylporphyrin identifiziert werden, die mit Streptavidin wechselwirken und dadurch die Biotin-Anbindung stark beeinträchtigen, so dass es bei der Biotin-FITC-Titration zu einer Unterbestimmung von funktionalem Streptavidin kommt. Durch das Anbinden von SAv über einen PEG-Linker konnte die NP-Oberfläche abgeschirmt werden, so dass die Wechselwirkungen von an der NP-Oberfläche befindlichem meso-Tetraphenylporphyrin mit SAv reduziert und die Funktionalität von Streptavidin erhalten werden konnte. Zudem wurde eine Methode entwickelt, um die Partikelstreuung bei der Absorptionsmessung zu korrigieren. Streptavidinfunktionalisierte, gefärbte Nanopartikel wurden anschließend in einem Immunoassay zum Nachweis von CRP getestet. Dazu wurden vier Qualitätsparameter (EC50-Wert, Detektionslimit (LOD), dynamischer bzw. relativer dynamische Bereich, Güte des Fits (R2)) aufgestellt, anhand derer die Assays in Bezug auf eine Steigerung der Sensitivität und Signalintensität untersucht wurden. Zudem wurden vier weitere Parameter wie Detektionsprinzip (Detektion von fluoreszenten Nanopartikeln versus Farbstofffreisetzung), Nanopartikelgröße, Farbstoffbeladung und Art der Streptavidinanbindung untersucht, welche einen Einfluss auf die Sensitivität und Signalintensität besitzen. Diese mit Cumarin 153-beladenen PS NP zeigten, dass bei der Verwendung hochbeladener Partikel höhere Fluoreszenzintensitäten durch die Extraktion des Farbstoffes mit Ethanol erreicht werden können. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Größe des Nanopartikels einen Einfluss auf spezifische und unspezifische Wechselwirkungen mit der Mikrotiterplatte sowie den daran adsorbierten Proteinen hat, was bei 500 nm Partikeln zu einem ungewollt höheren Untergrundsignal führte und zu einer geringen spezifischen Bindung. Der Einsatz PEGylierter Nanopartikel im Immunoassy konnte keine reproduzierbaren Ergebnisse liefern. Anhand verschiedener Beladungskonzentrationen konnte gezeigt werden, dass die Größe des Fluoreszenzsignals der farbstoffbeladenen Partikel das Signal hauptsächlich von der Quantenausbeute und der Anzahl der eingequollenen Farbstoffe und speziell für Cumarin 153 kaum vom molaren dekadischen Extinktionskoeffizienten abhängt und das Signal nicht bei der größten Beladungsmenge maximal wird. Wird der Farbstoff aus den Partikeln extrahiert, hängt die Signalintensität nur noch von der Anzahl der Farbstoffe ab. Screening-Experimente mit den Farbstoffen Cumarin 153, Nilrot, meso-Tetraphenylporphyrin, Lumogen R F305, Itrybe und Eu(TTFA)3(phen) zeigten, dass mit Cumarin 153 die besten Ergebnisse erzielt werden. Die anderen Farbstoffe schienen partiell die Anbindung der NP an den Immunkomplex zu stören oder zeigten verstärkte Lösch- und Aggregationseffekte. Beim Vergleich des entwickelten partikelbasierten Immunoassays mit einem ELISA lagen die EC50-Werte des Partikelassays um einen Faktor von 10 höher. Dies liegt eventuell an der schlechteren Bindung der Partikel an den Immunkomplex. Eine Steigerung der Nachweisstärke des partikelbasierten Immunoassays könnte eventuell durch eine Optimierung der Partikelgröße erreicht werden. Der Einsatz von kleineren Partikeln könnte die Sensitivität des partikelbasierten Immunoassays weiter steigern. Eventuell ist die Anbindung kleinerer Nanopartikel besser. Zudem ist ihr Platzbedarf kleiner, weshalb mehr Immunkomplexe je NP detektiert werden. Obwohl sie wesentlich weniger Farbstoffe tragen, könnte es ein Optimum zwischen der Anzahl der Farbstoffe und der NP-Größe sowie dem Platzbedarf geben, um möglichst sensitiv mit einem hohen Signal Analyten nachweisen zu können. Zudem sind nach den Untersuchungen zu unspezifischen und spezifischen Wechselwirkungen bei kleineren Polystyrolnanopartikeln noch geringere unspezifische Wechselwirkungen zu erwarten. Ein weiterer Ansatz könnte die Herstellung eines katalytischen Systems sein. Sofern ein Katalysator in Polystyrolpartikel eingequollen werden kann und anschließend ebenfalls ein Substrat umsetzt, könnte die Anzahl der detektierten Farbstoffe je Analyt noch weitaus größer ausfallen und so schon sehr geringe Mengen an Analyt detektieren, was ggf. die Sensitivität des Assays steigert.

The aim of the present work was the development of fluorescent nanoparticles, which could be used as label in an immunoassay to enhance the signal intensity and sensitivity. Therefore, systematic encapsulation strategies with varying neutral and ionic/ charged dyes were performed to identify influencing parameters like nanoparticle size, bioconjugation, and dye loading concentration. Two different types of particle systems were assessed in more detail in terms of their reproducible production and their applicability as nanoparticle label. Due to their stability, simple and reproducible production, narrow and defined particle size distribution, and availability with different surface functional groups together with the possibility to incorporate a precise amount of dyes, dye loaded polystyrene nanoparticles were identified as a suitable particle system. For the covalent coupling of streptavidin (SAv) on amino and carboxy functionalized polystyrene nanoparticles, required for assay development and antibody conjugation, two different conjugation strategies were tested, the coupling via EDC/ sulfo-NHS chemisty and via heterobifunctional PEG linker. Both coupling strategies are suitable to bind Streptavidin on the nanoparticle surface without nanoparticle aggregation. The amount of particle-bound SAv was quantified using the BCA and Biotin-FITC assay. The former assay provides the total amount of protein without information on its function whereas the latter measures solely the amount of functional, biotin-binding protein. As both assays are designed for quantification of SAv in solution, both assays had to be tested for interactions with dyes and the particle matrix and for influences from particle scattering and absorption as well as well fluorescence of the embedded dyes. It was shown that some dyes like certain coumarins can reduce the BCA copper(II) complex and as a result yield an overdetermination of SAv with the BCA assay. Furthermore, dyes like meso-tetraphenylporphyrine were identified, that affect SAv strongly, and as a result, lead to an underdetermination of SAv with the Biotin-FITC assay. In this respect, also a method was developed to consider particle scattering in absorption measurements. Coupling of SAv via PEG linker leads to a shielding of the nanoparticle surface, thereby reducing interactions between meso- tetraphenylporphyrine located close to or at the nanoparticle surface with SAv and preserving the functionality of SAv. SAv-functionalized, dye loaded nanoparticles were subsequently used as labels in a Sandwich immunoassay to determine c-reactive protein (CRP) and compared to a classical ELISA using an enzyme-functionalized detection antibody and the colorimetric substrate 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine. For the particle-based immunoassay, the biotinylated detection antibody was functionalized with these dye-stained, SAv-functionalized nanoparticles. Four quality parameters (average effective concentration (EC50), limit of detection (LOD), dynamic range/ relative dynamic range (DR/ RDR), and goodness of fit (R2)) were chosen that allowed to evaluate the immunoassays in terms of signal intensity enhancement and sensitivity. In this respect, also the influence of the principle of signal generation (detection of fluorescent nanoparticles versus dye extraction and measurement of dissolved dye molecules) as well as the influence of nanoparticle size, dye loading concentration, and SAv conjugation chemistry were studied. These studies showed an influence of nanoparticle size on the specific and unspecific interactions of SAv with the microtiter plate and the adsorbed proteins, accounting for the higher background signal and low specific binding observed for 500 nm-sized nanoparticles. The use of PEGylated nanoparticles in immunoassays provided no reproducible results. Initially performed screening tests with the different staining dyes Coumarin 153, Nile Red, Lumogen R F305, Itrybe and Eu(TTFA)3(phen) showed that Coumarin 153 gives the best results. The other dyes seem to hinder partially the binding of the nanoparticles on the immune complex or showed more fluorescence quenching or aggregation effects. Subsequently performed systematic studies, focusing on mainly on Coumarin 153-stained nanoparticles, revealed that the signal size clearly depended on dye properties like the fluorescence quantum yield as well as on the amount of incorporated dye molecules and a signal enhancement could be demonstrated for the dye extraction approach. A comparison of the developed particle-based immunoassay and an ELISA revealed a 10-fold higher EC50 value for the particle-based immunoassay. This could be due to a less good binding of the particles on the immune complex. Most likely, an increase of the signal intensity/ sensitivity of the particle-based immunoassay could be achieved by further optimization of the particle size and it is anticipated that the use of smaller particles could increase the sensitivity of the particle-based immunoassay. Although smaller nanoparticles can incorporate only a lower amount of dyes, there seem to be an optimum between the amount of incorporated dyes, the nanoparticle size, and the required space (a big nanoparticle could hide more unlabeled immune complexes, than a small nanoparticle) to quantify analytes sensitively with a high signal. Furthermore, unspecific adsorption is expected to be lower for smaller particles. An alternative approach to enhance the sensitivity of particle-based assays could present the use of a catalytic system. In this case, a catalyst could be incorporated into the nanoparticles, which then turns a substrate into a colored or fluorescent product after extraction of the catalyst.