The zebrafish genome: Strategies and applications for physical and radiation hybrid mapping

Abstract

The zebrafish has been shown to be a powerful system for the genetic, molecular and embryological study of vertebrate development. In spite of a growing number of available genomic resources (genetic maps, radiation hybrid maps, genomic libraries, cDNA libraries) the cloning of genes disrupted in mutants is still difficult and time-consuming. The availability of physical maps of the genome anchored to the genetic and radiation hybrid maps can facilitate the identification and cloning of mutated genes and is crucial as a framework for sequencing the genome. Gene catalogues containing expression and mapping data of transcripts also help to identify candidate genes for mutations and hence have the potential to enable the cloning of the affected genes. The subject of this thesis is the establishment and application of physical and radiation hybrid mapping techniques in the zebrafish genome. The work can be divided in three parts: In the first part, interspersed repetitive sequence (IRS)-PCR was adapted and optimised for the zebrafish system, especially for physical and radiation hybrid mapping. Different repetitive elements, primer annealing sites and PCR conditions were tested. A new zebrafish repetitive element was identified and characterised. Libraries of IRS-PCR products derived from 5 different zebrafish strains were constructed and 27,000 clones were picked. The libraries were normalised and clustered by oligonucleotide fingerprinting, suggesting 11,000 different IRS-PCR products in the library. This method also identified IRS products with +/- polymorphism among different zebrafish strains. IRS-PCR products were further characterised by sequencing. The average frequency of single nucleotide polymorphisms (SNPs) between IRS-PCR products of different strains tested was found to be p = 0.013. Thus IRS-PCR products can serve as a reduced representation subset of the zebrafish genome for SNP mapping and detection. Radiation hybrid mapping of IRS-PCR products was established. Part two describes the construction of a physical framework map of zebrafish linkage group 20. A mapping procedure was set up by hybridising STS-derived oligonucleotides on a PAC library, and by hybridising IRS-products to YAC and PAC pools. So far, 344 STS derived oligonucleotide probes and 284 IRS probes have been used. A total of 3416 PACs were identified as positive, and are currently being restriction fingerprinted for integration in the Tuebingen restriction fingerprinting map and for selection of tiling paths for sequencing. A subset of the hybridisation results was used for contig construction. This consisted of 388 probes, hitting 2007 clones, representing a marker density of 1 per 205 kb. The contig assembly resulted in 249 contigs, of which 19% were anchored by more than one probe. These data agree with theoretical predictions. Thus, an STS-based framework map of zebrafish chromosome 20 has been constructed, which is anchored to genetic and radiation hybrid maps, and integrated in the restriction fingerprint map. This is the first map of its kind of a zebrafish chromosome. In the third part of this work zebrafish ESTs with homologies to human disease genes or with localised expression patterns were mapped on the radiation hybrid map. So far we mapped > 120 clones. The aim of this work is to identify candidate genes for zebrafish mutations and to refine the map of human:zebrafish syntenic relations; synteny data itself are used to determine if sequences homologous between zebrafish and human are true orthologues.

Der Zebrafisch ist ein wichtiger Modellorganismus für genetische, molekulare und embryologische Untersuchungen der Embryonalentwicklung. Obwohl immer mehr genomische Ressourcen zur Verfügung stehen (genetische Karten, Bestrahlungshybridkarten, genomische Bibliotheken, cDNA Bibliotheken), ist die Klonierung von Genen, die durch einer Mutante entdeckt wurden, schwierig und zeitaufwendig. Eine physikalische Karte des Genoms, die mit genetischen und Bestrahlungshybridkarten verankert ist, kann die Identifizierung und Klonierung mutierter Gene erleichtern und dient als Grundlage für die Sequenzierung des Genoms. Genkataloge mit Expressions- und Kartierungsdaten sind entscheidend für die Auswahl von Kandidatengenen und ermöglichen daher die Identifizierung mutierter Gene. Das Thema dieser Arbeit ist die Entwicklung und Anwendung der physikalischen Kartierung und Bestrahlungshybridkartierung im Zebrafisch. Die Arbeit gliedert sich in drei Teile: Im ersten Teil wird beschrieben, wie die auf eingestreute repetitive Elemente beruhende Polymerase-Kettenreaktion (IRS-PCR) an das Zebrafischgenom angepaßt und optimiert wurde, insbesondere für die physikalische und Bestrahlungshybridkartierung. Dazu wurden verschiedene repetitive Elemente, Primerbindestellen und PCR Bedingungen getestet. Ein neuer Zebrafischrepeat wurde gefunden und charakterisiert. Eine Markerbank aus IRS-PCR Produkten von fünf Zebrafischstämmen wurde konstruiert, und 27.000 Klone wurden gepickt. Diese Markerbanken wurden durch Oligunukleitid-Fingerprinting normalisiert, wodurch etwa 11.000 verschiedene Sequenzen identifiziert werden konnten. Dadurch wurden auch Produkte mit +/- Polymorphismus in den verschieden Stämmen identifiziert. IRS-PCR Produkte wurden durch Sequenzierung näher charakterisiert. Die Durchschnittsfrequenz von SNPs (single nucleotide polymorphisms) beträgt p = 0.013. Aus diesem Grund ist unsere normalisierte IRS-PCR Markerbank ein geeignetes repräsentatives Subset des Genoms für die SNP-Detektion. Die Kartierung von IRS-PCR Produkten mittels der Hybridisierung auf Bestrahlungshybride wurde ebenfalls entwickelt. Im zweiten Teil wurde eine physikalische Rahmenkarte der Kopplungsgruppe 20 des Zebrafischs erstellt. Ein Kartierungsverfahren wurde entwickelt, in dessen Verlauf kartierte Oligonukleotide auf eine PAC-Bibliothek und IRS-Marker auf YAC- und PAC-Pools hybridisiert wurden. Bis zum jetzigen Zeitpunkt wurden 344 Oligonukleotid- und 284 IRS Sonden verwendet. Insgesamt wurden 3416 PACs getroffen, die zur Zeit durch Restriktions-fingerprinting analysiert werden. Dadurch werden sie in die Tübinger Restriktionskarte integriert und ein Klonpfad für die genomische Sequenzierung wird konstruiert. Ein Teil der Hybridisierungsergebnisse wurde für die Konstruktion von Contigs verwendet. Dies umfaßte 388 Sonden, die 2007 Klone trafen, und damit eine Markerdichte von 1/205 kb repräsentieren. Das Contigassembly besteht aus 249 Contigs, von denen 19% durch mehr als eine Sonde verankert sind. Diese Daten stimmen mit der theoretischen Erwartung überein. Auf diese Weise wurde eine physikalische STS-Rahmenkarte des Chromosoms 20 des Zebrafischs erstellt, die mit den genetischen und Bestrahlungshybridkarten verankert und in die Restriktionsfingerprintkarte integriert ist. Dies ist die erste derartige Karte eines Zebrafischchromosoms. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden Zebrafisch ESTs, die humanen Krankheitsgenen sequenzhomolog sind oder spezifische Expressionsmuster zeigen, auf der Bestahlungshybridkarte positioniert. Bis jetzt wurden > 120 Klone auf diese Weise kartiert. Ziel dieses Teils der Arbeit ist die Identifizierung von Kandidatengenen für Zebrafischmutationen und die verfeinerte Kartierung der Syntänieverhältnisse zwischen Mensch und Zebrafisch. Die Syntäniedaten dienen zur Bestimmung, ob es sich bei homologen Sequenzen von Mensch und Zebrafish um Orthologe oder Paraloge handelt.