Functional analysis of the signal peptide of the Protease Activated Receptor 1 (PAR1)

Abstract

The heptahelical G protein-coupled receptors (GPCRs) represent a huge protein family and are the most important drug targets in pharmacology. A subfamily of GPCRs forms the protease-activated receptors (PARs) which are activated by N terminus proteolysis. To this subfamily belongs the protease-activated receptor 1 (PAR1) which is activated by cleavage of its N terminus by thrombin. Proteolysis in turn uncovers a tethered ligand transactivating the receptor. Thrombin cleaves between amino acid residues Arg41 and Ser42 of PAR1 and releases a peptide into the extracellular space, namely parstatin, which was recently shown to have a regulatory function in angiogenesis and in myocardial ischemia and reperfusion injury. It was previously thought that this extracellular parstatin peptide indeed contains residues Met1-Arg41. However, the actual length of the parstatin peptide is unclear since the receptor also possesses a putative signal peptide (Met1-Ser21) at its N terminus according to prediction programs. Signal peptides mediate the targeting of nascent chains to the membrane of the endoplasmic reticulum (ER), the first step of the intracellular protein transport. They are normally cleaved off following integration of a protein into the ER membrane (membrane protein) or translocation across it (secretory proteins). Thus, if the putative signal peptide of the PAR1 is functional, parstatin released at the extracellular side by thrombin cleavage would be shorter and only contain residues Ala22-Arg41. In this work it was studied, whether the signal peptide of PAR1 is indeed functional and cleaved addressing the question of actual parstatin length. By fusing the N terminus of PAR1 to the cytosolic green fluorescent protein (GFP), the GFP moiety was converted to a secretory protein demonstrating that the PAR1 indeed possesses a signal peptide which is able to mediate ER targeting and which is cleaved off in the early secretory pathway. These results were confirmed by experiments using a full length receptor construct possessing a FLAG tag preceding the signal peptide: in this case, the FLAG tag was removed from the full length receptor together with the signal peptide. In summary, it was shown that extracellularly-released parstatin contains only residues Ala22-Arg41 and not residues Met1-Arg41. Since it is aimed to use parstatin to treat various pathological situations, these results are significant for the future research on this peptide. During this study, a signal peptide deletion mutant of the PAR1 was constructed. Previous studies with other GPCRs have shown that when a signal peptide is deleted, the first hydrophobic domains of the receptors are able to take over signalling functions for ER targeting/insertion as so called signal anchor sequences. The signal peptide mutants are thus normally expressed, also sometimes in reduced amounts. In the case of the PAR1, however, expression of the signal peptide mutant was almost completely abolished. The mechanism underlying this phenomenon was addressed and it could be shown that the first transmembrane domain of the PAR1 is unexpectedly unable to function as a signal anchor sequence. However, the impaired expression of the signal peptide mutant of the PAR1 seems to rely on an even earlier step of protein biogenesis. Experiments addressing PAR1 mRNA degradation indicate that the sequence encoding the signal peptide is necessary for a stable mRNA by forming a stem loop secondary structure, a hypothesis which could be confirmed by bioinformatic analyses. Such a function was never described before for a GPCR.

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) bilden eine sehr große Proteinfamilie und sind in der Pharmakologie die wichtigsten Zielmoleküle für Wirkstoffe. Die Protease-aktivierten Rezeptoren stellen eine Unterfamilie der GPCR dar, die durch N-terminale Proteolyse aktiviert werden. Zu dieser Gruppe gehört der Protease-aktivierte Rezeptor 1 (PAR1), dessen N-Terminus durch Thrombin gespalten wird. Dadurch wird ein Ligand freigegeben, der Teil des reifen Rezeptors ist und diesen transaktiviert. Thrombin spaltet den PAR1 zwischen den Aminosäureresten Arg41 und Ser42 und setzt dadurch auch ein extrazelluläres Peptid frei, das Parstatin genannt wurde. Eine Vielzahl von Arbeiten schreibt diesem Peptid regulatorische Funktionen bei der Angiogenese und bei der Antwort auf einen Myokardinfarkt zu. Da Thrombin zwischen Arg41 und Ser42 spaltet, wurde bisher davon ausgegangen, dass das extrazellulär freigesetzte Parstatin die Sequenz von Met1 bis Arg41 umfasst. Diese Parstatinlänge ist allerdings in Frage zu stellen, da der PAR1 nach bioinformatischen Analysen an seinem N-Terminus auch über ein abspaltbares Signalpeptid verfügen könnte (Met1-Ser21). Signalpeptide vermitteln den Transport neuentstehender Proteine zur Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER), d.h. den ersten Schritt des intrazellulären Proteintransports. Nachdem ein Protein in die ER-Membran integriert (Membranproteine) oder über diese transloziert wurde (sekretorische Proteine), werden Signalpeptide normalerweise rasch abgespalten. Wenn das putative Signalpeptid des PAR1 tatsächlich funktionell wäre, würde dies aber bedeuten, dass extrazellulär freigesetztes Parstatin kürzer wäre als bisher angenommen und nur die Aminosäurereste Ala22-Arg41 umfassen würde. In dieser Arbeit wurde die Frage nach der tatsächlichen Parstatinlänge aufgegriffen und untersucht, ob der PAR1 tatsächlich über ein funktionelles und abspaltbares Signalpeptid verfügt. Hierfür wurde der N-Terminus des Rezeptors mit dem cytosolischen grünfluoreszierenden Protein (GFP) fusioniert. Es konnte mit verschiedenen Experimenten gezeigt werden, dass dadurch das GFP-Protein in ein sekretorisches Protein umgewandelt wird. Dies beweist, dass der PAR1 tatsächlich ein Signalpeptid enthält, dass das ER-Targeting vermittelt und dann abgespalten wird. Diese Daten wurden durch Experimente mit vollständigen Rezeptoren bestätigt, bei denen ein FLAG-Tag vor dem Signalpeptid fusioniert wurde. In diesem Fall wurde der FLAG-Tag zusammen mit dem Signalpeptid vom Rezeptor abgespalten. Zusammengefasst kann daher festgehalten werden, dass extrazellulär freigesetztes Parstatin nur die Aminosäurereste Ala22-Arg41 umfasst. Da es Planungen gibt, Parstatin auch zu therapeutischen Zwecken einzusetzen, sind diese Ergebnisse für die zukünftige Forschung an diesem Peptid von Bedeutung. Im Verlauf dieser Arbeit wurde auch eine Signalpeptid- Deletionsmutante des PAR1 konstruiert. Für andere GPCR konnte gezeigt werden, dass die Expression solcher Deletionsmutanten normalerweise nur etwas vermindert ist, da die erste Transmembrandomäne des reifen Proteins die Signalisierung an der ER-Membran als sogenannte Signalankersequenz übernehmen kann. Im Falle des PAR1 wurde die Rezeptorexpression durch diese Deletion dagegen fast vollständig unterbunden. Es wurde daher noch untersucht, welcher Mechanismus diesem Phänomen zugrunde liegt. Es konnte gezeigt werden, dass die erste Transmembrandomäne des Proteins nicht als Signalankersequenz funktionieren kann. Der tatsächliche Grund für die Verhinderung der PAR1-Expression scheint aber auf einer noch früheren Stufe der Biogenese des Rezeptors zu liegen: Es konnte gezeigt werden, dass die Sequenz, die das Signalpeptid des PAR1 kodiert, für die Ausbildung einer stabilen mRNA notwendig ist, indem sie die Ausbildung eines Stem-Loops ermöglicht. Eine solche Funktion wurde bisher für einen GPCR nicht beschrieben.