In vitro induction and expansion of CD8 positive T cells: a method applicable for the generation of low-frequency antigen specific CD8 positive T cells

Abstract

Reliable methods for the priming and in vitro expansion of antigen specific cytotoxic T lymphocyte cells (CTLs) are necessary for the adoptive immunotherapy with low-frequency precursors. Although several methods for the expansion of in vivo primed CTLs have been reported, the need for an efficient protocol to prime and expand low-frequency and naive CD8 positive cells in vitro still remains a challenge. Here, we report on a method to efficiently expand in vitro low frequency antigen-specific T cells from antigen-naïve individuals. HLA A2 binding peptides of known immunogenicity from human immunodeficiency virus antigens (HIV), hepatitis C (HCV), and hepatitis B core antigens (HBV) were selected to prime in vitro naive T cells from healthy volunteers (negative for HIV, HBV, HCV). To optimize the induction procedure, four different cytokine cocktails including IL-6, IL-7, IL-10, IL-12 and IL-15 in various combinations and concentrations were tested. Antigen-pulsed mature dendritic cells (mDCs) did not enhance the priming efficiency when compared to that of the antigen alone. Among three different re-stimulation protocols, the most effective re-stimulation procedure required the use of irradiated, autologous and peptide-pulsed peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The cultures were supplemented with IL-2 from day 3 of the culture on. In most experiments, we were able to generate antigen-specific T cell response as demonstrated by the antigen-specific release of IFN-[gamma] and tetramer staining. We also applied the method to generate specific CTL cultures with tumour-associated antigens. All twelve screened tumour-associated antigens proved to be sufficiently immunogenic for healthy individuals to generate an antigen specific response. Furthermore, the experiment with enriched memory and naive T cells confirmed our thesis that only the antigen specific T cells can be generated from naive precursors. Moreover, we applied an optimized method (using a cytokine cocktail including IL-6 and IL-12) which was able to successfully generate WT-1 specific CTLs under GMP conditions. PBMCs were obtained from a healthy steam cell donor, who is a sister of our AML patient. Six months after bone marrow transplant our patient suffered a relapse of her haematological malignancy. As part of the individualised experimental conditioning protocol, WT-1 specific T cells were used. Patients received all in all 6 x 108 T cells, from which 4.38 x 107 WT-1 specific T cells. All short- and long-term adverse events were taken into account. In conclusion, this simple and effective approach can be utilized to generate CTLs of desired antigen specificity for an adoptive therapy in viral or malignant diseases.

Zuverlässige Methoden zur Induktion und In-vitro-Expansion von Antigen- spezifischen T-Zellen bilden die Grundlage zur Etablierung eines suffizienten adoptiven T-Zelltransfers von niedrig-frequenten oder sogar naiven T-Zellen. Obwohl mehrere Methoden zur In-vitro-Induktion und Expansion von naiven T-Zellen bereits beschrieben wurden, konnte bislang keine dieser Methoden im klinischen Alltag etabliert werden. In dieser Arbeit gelang die Etablierung einer Methode zur effizienten In-vitro-Expansion von niedrig-frequenten Antigen-spezifischen T-Zellen von gesunden Antigen-naiven Spendern. Es wurden HLA.A2 positive, potenziell immunogene Antigene des Humanen Immundefizienz- Virus, der Hepatitis C und des Hepatitis-B-Core-Proteins ausgewählt und zur In-vitro-Induktion von naiven T-Zellen bei gesunden Spender eingesetzt. Um die Induktionsprozedur zu optimieren, wurden vier Zytokin-Cocktails mit verschiendenen IL-6, IL-7 IL-10, IL-12 und IL-15 Kombinationen und Konzentrationen eingesetzt. Darüber hinaus wurde die Induktionseffizienz von reifen, Peptid beladenen dendritischen Zellen mit Zugabe von Antigen alleine verglichen. Durch den Einsatz von dendritischen Zellen konnte keine Steigerung der Induktionseffizienz erreicht werden. Als effektivstes Restimulationsprotokoll hat sich die Zugabe von bestrahlten, Peptid beladenen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) erwiesen. Zusätzlich wurden die Zellkulturen mit IL-2 ab Tag 3 supplementiert. In überwiegender Mehrheit der Experimente, konnte eine Antigen-spezifische T-Zell Antwort generiert werden. Die spezifische CD3+/CD8+ T-Zellen konnten mittels IFN-[gamma ]-Sekretions-Assay sowie MHC-Multimer-Färbung nachgewiesen werden. Die entwickelte Methode zur Induktion und Expansion Antigen-spezifischer T-Zellen wurde zur Generierung Tumor-spezifischer T-Zellen eingesetzt. Zwölf immunogene Tumor-assoziierte Antigene (TAA) wurden eingesetzt und konnten Antigen- spezifische Antworten bei gesunden Spendern generieren. Um die Induktion einer Antigen-spezifischen T-Zell Antwort durch naive T-Zellen zu beweisen, wurde ein Experiment mit angereichten naiven und Gedächtnis-T-Zellen durchgeführt. Antigen-spezifische T-Zellen konnten aus naiven T-Zellen generiert werden. Diese verbesserte Methode (mit Einsatz von IL-6 und IL-12) wurde zur Generierung von WT-1 spezifischen zytotoxischen T-Zellen unter GMP Bedingungen benutzt. PBMCs für diesen Ansatz wurden von einer gesunden Spenderin (Zwillingsschwester einer AML Patientin) gewonnen. Sechs Monate nach allogener Stammzelltransplantation von der Zwillingsschwester wurde ein Rezidiv der vorbekannten AML diagnostiziert. Bei fehlenden standardisierten Therapieoptionen wurden in Rahmen eines Heilversuches diese Tumor-spezifischen T-Zellen eingesetzt. Die Patientin erhielt 6 x 108 T-Zellen, davon 4,38 x 107 WT-1 spezifische T-Zellen. Es wurden keine Nebenwirkungen beobachtet. Zusammenfassend zeigen die vorgelegten Ergebnisse, dass eine einfache und effektive Induktion und Expansion Antigen-spezifischer T-Zellen gewünschter Spezifität möglich ist und durch adoptiven T-Zelltransfer zur Therapie von viralen sowie Tumorerkrankungen angewendet werden kann.