Investigations on the viability as well as on the molecular and serological characterization of Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) isolates

Abstract

Ornithobacterium rhinotracheale (O. rhinotracheale, ORT) is a gram-negative staining rod. In chickens and turkeys O. rhinotracheale causes a respiratory disease. Isolation of the bacterium from infected flocks is necessary for serotyping, to produce autogenous vaccines, and to determine the antimicrobial susceptibility for an effective therapy. Therefore, in the first part of the thesis, a series of experiments was carried out to determine optimal conditions for storage of swabs soaked in O. rhinotracheale suspension to simulate the transport of swabs for isolation of O. rhinotracheale to the laboratory. Swabs were immersed in O. rhinotracheale suspensions with different bacterial counts and then stored under different conditions. At several time points the viable O. rhinotracheale count in the swabs was determined. Dry cotton swabs as well as three transport media, namely Amies gel medium, Amies gel medium with charcoal (AC), and Stuart gel medium were compared. O. rhinotracheale was reisolated from dry swabs stored at room temperature for up to five days and from swabs stored in the media at room temperature for more than seven days. Differences among the transport media were minor. The minimal number of cfu in the O. rhinotracheale suspension in which the swabs were soaked was 105 cfu/ml for successful reisolation of O. rhinotracheale one day post immersion from swabs stored at room temperature in Amies gel medium with charcoal, and 106 cfu/ml was successful for reisolation from dry swabs. Higher inoculation doses and storage at 4°C prolonged the period in which O. rhinotracheale could be reisolated. Storage of dry swabs at -20°C allowed reisolation of O. rhinotracheale at a constant level for at least five days. Inoculation of swabs with O. rhinotracheale and E. coli reduced the period during which O. rhinotracheale was reisolated. In the second part of the thesis information about diagnosis and serotyping of O. rhinotracheale isolates at the Institute of Poultry Diseases of the Free University Berlin was compiled and analyzed. Between 2009 and 2011 714 dry swabs taken from diseased turkeys, broilers, broiler breeders, layers, or from unknown origin were investigated by PCR for the presence of O. rhinotracheale. One hundred ninety seven out of 481 swabs from turkeys (41.0 %), 10 out of 144 swabs from broilers or broiler breeders (6.9 %), 17 out of 28 swabs from layers (60.7 %), and 26 out of 61 swabs from unknown origin (42.6%) were tested positive. The results of three swabs from turkeys were suspect. Furthermore 310 isolates from turkeys and 62 isolates from unknown origin were typed using agar gel precipitation test with antisera prepared for this study. 56.1 % of isolates from turkeys belonged to serotype A and 20.6 % to serotype E. The prevalence of other serotypes was below 10 %. Serotypes D, F, and K were not detected. Eleven isolates were not typable with reference sera against serotypes A – L. The three serotypes most often found in the isolates from unknown origin were A (35.5 %), B (19.4 %), and C (12.9 %). The prevalence of other isolates was below 10 %. Serotypes F and K were not detected. Seven isolates were not typable with reference sera A – L. Cross reactions, especially of serotype A isolates with serotypes I, H and J, were common. Further the partial 16S ribosomal RNA (rRNA) and the complete Or01 genes of reference strains A – H and of nine field isolates were cloned and sequenced. Identity scores of 16S rRNA fragments were between 98 % and 100 %. Identities of the Or01 sequences were between 94 % and 100 %. Phylogenetic trees of both genes showed similarities. However, there was no apparent correlation between reference strains and isolates belonging to one serotype, so sequencing of 16S rRNA or of the Or01 gene does not seem to be a suitable method to replace the AGP for serotyping.

Ornithobacterium rhinotracheale (O. rhinotracheale, ORT) ist ein a gram- negatives, stäbchenförmiges Bakterium, das bei Hühnern und Puten Erkrankungen der Atemwege hervorrufen kann. Die Isolierung des Bakteriums ist von großer Bedeutung zur Serotypisierung, zur Herstellung stallspezifischer Impfstoffe sowie zur Testung der Resistenzenlage für eine erfolgreiche Therapie. Deshalb wurden im ersten Teil der vorliegenden Arbeit eine Reihe von Versuche durchgeführt, um die bestmöglichen Bedingungen für Transport und Aufbewahrung von O. rhinotracheale -Tupferproben zu bestimmen. Dafür wurden die Tupfer in O. rhinotracheale -Suspensionen mit einem unterschiedlichen Keimgehalt getränkt und unter verschiedenen Bedingungen aufbewahrt. Nach verschiedenen Lagerdauern wurde die Keimzahl von O. rhinotracheale in den Tupfern bestimmt. Zunächst wurden Trockentupfer aus Baumwolle sowie Tupfer in drei Transportmedien, und zwar Amies Gel Medium, Amies Gel Medium mit Aktivkohle sowie Stuart Gel Medium, getestet. Aus Trockentupfern, die bei Zimmertemperatur aufbewahrt wurden, konnte O. rhinotracheale über bis zu fünf Tage reisoliert werden, aus den in Medium aufgenommen Tupfern über mindestens sieben Tage. Die Unterschiede zwischen den Medien waren gering. Für eine erfolgreiche Reisolierung von O. rhinotracheale nach einem Tag aus Tupfern, die bei Zimmertemperatur in Amies Gel Medium mit Aktivkohle aufgenommen wurden, musste der Keimgehalt in der O. rhinotracheale -Suspension zur Kontamination der Tupfer mindestens 105 cfu/ml betragen. Für Trockentupfer lag der Wert bei 106cfu/ml. Höhere Inokulationsdosen und eine Lagerung bei 4°C verlängerten die Zeit, während der O. rhinotracheale reisoliert werden konnte. Aus bei -20°C gelagerten Trockentupfern wurden annähernd gleich bleibende Keimzahlen von O. rhinotracheale über mindestens fünf Tage nachgewiesen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Informationen über die Diagnose und Serotypisierung von O. rhinotracheale am Institut für Geflügelkrankheiten der Freien Universität Berlin zusammengestellt und analysiert. Zwischen 2009 und 2011 wurden 714 Trockentupfer aus Puten-, Broiler- oder Legehennenherden mit Atemwegserkrankungen sowie aus Herkünften, zu denen von den Einsendern keine Angaben gemacht wurden, mittels PCR auf O. rhinotracheale -DNA untersucht. 197 von 481 Tupfern von Puten (41,0 %), 10 von 144 Tupfern von Broilern (6,9 %), 17 von 28 Tupfern von Legehennen (60,7 %) sowie 26 der 61 Tupfer ohne nähere Angaben (42,6 %) wurden positiv getestet. Das Ergebnis der Untersuchung von drei Tupfern von Puten war fraglich. Ferner wurden 310 Isolate von Puten und 62 Isolate ohne nähere Angaben mit für diese Arbeit hergestellten Seren im AGP serotypisiert. 56,1 % der Isolate von Puten gehörten zu Serotyp A und 20.6 % zu Serotyp E. Die Prävalenz der anderen Serotypen lag unter 10 %. Kein Isolat gehörte den Serotypen D, F und K an. Elf Isolate waren mit den Referenzseren gegen die Serotypen A – L nicht typisierbar. Die drei Serotypen, die bei den Isolaten ohne nähere Angaben am häufigsten gefunden wurden, waren A (35.5 %), B (19.4 %) und C (12.9 %). Die Prävalenz der anderen Serotypen lag unter 10 %. Kein Isolat gehörte den Serotypen F und K an. Sieben Isolate waren mit den Referenzseren gegen die Serotypen A – L nicht typisierbar. Kreuzreaktionen, insbesondere zwischen Serotyp A mit den Serotypen I, H und J traten häufig auf. Zuletzt wurde ein Teil des Gens der 16S ribosomalen RNA (rRNA) und das gesamte Or01 Gen der Referenzstämme A bis H und von neun Feldisolaten kloniert und sequenziert. Die Homologien der 16S rRNA Sequenzen lagen zwischen 98 % und 100 %, die der Or01 Sequenzen zwischen 94 % and 100 %. Die phylogenetischen Bäume beider Gene zeigten Ähnlichkeiten, allerdings gab es keinen erkennbaren Zusammenhang zwischen den Refernzstämmen und den Feldisolaten desselben Serotyps. Insofern scheint die Sequenzierung des 16S rRNA Gens oder des Or01 Gens keine geeignete Methode zu sein, um die Serotypisierung mittels AGP zu ersetzen.