Konstruktion von genetischen Immunogenen zur Induktion und Charakterisierung einer protektiven Immunantwort gegen AIDS

Abstract

Trotz weltweiter Bemühungen ist es bisher noch nicht möglich gewesen, einen Impfstoff gegen HIV zu entwickeln. In dieser Arbeit wird die Herstellung eines attenuierten Virus zur Untersuchung von Schutzmechnismen in Tiermodellen als auch die Konstruktion eines möglichen Impfstoffes bzw. eines DNA-Immunogenes beschrieben. Im ersten Projekt wurden die Grundlagen für ein Tierexperiment geschaffen, mit dem der durch nef deletion-SIV Infektion vermittelte Schutz vor Wildtyp-Superinfektion untersucht werden kann. Ermöglicht wird dieser experimentelle Ansatz durch Einsatz eines SIV/HIV-Hybrid (SHIV) Genoms, der eine spezifisch hemmbare Reverse Transkriptase aus HIV-1 trägt (RTSHIV). Nach Subklonierung des RTSHIV-nef-Gens konnte mittels PCR-Techniken zwei Deletionsmutanten hergestellt werden, die durch unterschiedlich große Deletionen auch verschiedene Replikationseffizienzen in vivo besitzen sollten. Diese deletierten nef-Genbereiche wurden wiederum in den RTSHIV-Molekularklon eingesetzt. Die delta181-nef-RTSHIV Mutante trägt eine Deletion von 181 Basenpaaren im nef-Gen, was den gesamten Bereich von nef beinhaltet, der nicht mit env oder der 3'-LTR überlappt. Durch die resultierende Leserahmen- Verschiebung entsteht ein auf 62 Aminosäuren trunkiertes Protein. Die C8-delta nef-RTSHIV Mutante trägt eine in-frame Deletion von 12 Basenpaaren, es entsteht ein dem Wildtyp gegenüber um vier Aminosäuren deletiertes Nef- Protein. Es wurde für beide delta nef-RTSHIV gezeigt, das sich durch Transfektion der Molekularklone infektiöse Viren erzeugen lassen. Das Vorhandensein der Deletionen sowie der HIV Reversen Transkriptase in den Virionen wurde duch Sequenzierung nachgewiesen. Die Sensitivität gegenüber dem für HIV spezifischen Non-Nukleosid-Analoga Reverse Transkriptase Inhibitor (NNRTI) Nevirapin wurde in vitro nachgewiesen; für den Wildtyp-Virus SIVmac239 wurde die unbeeinträchtigte Replikation gezeigt. Das zweite Projekt beinhaltet die Konstruktion eines Virusstamm-spezifischen DNA-Immunogens. Als Basis wurde eine A/G-rekombinante Sequenz eines Primärisolates aus Nigeria (AG Fr. Dr. Kücherer, RKI) gewählt, diese unterscheidet sich durch ihr Mosaikgenom von den intensiv untersuchten HIV-1 Subtyp B, der oft Grundlage der Vakzine-Forschung in West-Europa ist. Es wurden die tat- und gag-Gene sequenziert und auf vorzeitige Stop-Codons und CTL-Epitope hin analysiert, unter Berücksichtigung der zu Verfügung stehenden Information über die Verbreitung bestimmter HLA- Allele in Nigeria. Tat und gag wurden in einen Expressions- oder Immunisierungsvektor kloniert, durch Sequenzierung verifiziert und auf Expression der Proteine in Zellinien getestet. Um die Expression zu optimieren wurde das Verfahren der Codon-Optimierung eingesetzt, in folge dessen die Basensequenz beider Gene unter Berücksichtigung der humanen Codon-Verwendung neu geschrieben wurde. Dadurch wurden inhibitorische und cis-active, regulatorische Sequenzen in gag entfernt sowie in tat und in gag immunstimulatorische CpG-Motive eingefügt, ohne das die Aminosäuresequenz der Proteine verändert wurde. Kurze, 40 oder 80 Basen lange Oligonukleotide wurden über verschiedene Methoden der PCR zu Konstrukten von 303 Basenpaaren für tat bzw. 1491 Basenpaaren für gag zusammen gesetzt und diese in den Expressionsvektor eingefügt. Die Expressionsstärke der Wildtyp-Gene und der Codon-optimierten Gene von tat und gag wurde durch Western-Blot verglichen; bei den gag enthaltenen Vektoren wurde durch eine Kotransfektion mit GFP und einem p24-ELISA die um Faktor 800 stärkere Expression der Codon-optimierten Konstrukte nachgewiesen.

Despite intense global efforts, all attempts to develop a vaccine against HIV have so far failed. This work describes the production of an attenuated virus to facilitate the identification of protective mechanisms in the animal model and the construction of a putative vaccine or DNA immunogen. In the first project, the basis for an animal experiment was developed in which the mechanism of protection against wild-type virus challenge induced by nef- deletion SIV infection can be investigated. This was made possible by using an SIV/HIV hybrid genome (RTSHIV) carrying the reverse transcriptase of HIV-1, an enzyme that can be specifically inhibited. Following subcloning of the RTSHIV nef gene, two deletion mutants were produced using PCR techniques that, due to different deletions, should lead to different replicative efficiencies in vivo. These deleted nef genes were reinserted into the RTSHIV molecular clone. The delta181-nef-RTSHIV mutant carries a 181 base pair deletion in the nef gene corresponding to the region of nef which does not overlap with env or the 3'-LTR. As a result of a reading-frame shift, this deleted gene codes for a protein truncated by 62 amino acids. The C8-delta nef-RTSHIV carries an in- frame deletion of 12 base pairs yielding a Nef protein deleted by four amino acids compared to that of the wild-type virus. Both delta nef-RTSHIV molecular clones were shown to produce infectious virus upon transfection. The presence of the deletions and the HIV reverse transcriptase was confirmed by sequencing. Sensitivity to the HIV-specific non-nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitor (NNRTI) Nevirapine was demonstrated in vitro whereas the wild-type virus SIVmac239 was shown to replicate normally. The second project involved the construction of a virus strain-specific DNA immunogen based on the sequence of a clade A/G recombinant primary isolate from Nigeria (provided by Dr. Kücherer, RKI). Due to it's mosaic genome, this virus differs significantly from the intensely studied HIV-1 clade B viruses upon which vaccine research in Western Europe is often based. The tat and gag genes were sequenced and analysed for the presence of premature stop codons and for CTL- epitopes with regard to HLA allele distribution in Nigeria. Tat and gag were cloned into expression and immunisation vectors, verified by sequencing and tested for protein expression in cell culture. To optimise expression, both genes were subjected to codon optimisation, i.e. the sequences of the genes were redesigned taking human codon usage into consideration. As a result, inhibitory and cis-active regulatory sequences in gag were removed and immunstimulatory CpG motives added to tat and gag without altering the resulting amino acid sequences. Using various PCR methods, the 303 base pair tat and the 1491 base pair gag genes were built from short oligonucleotides (40 or 80 bases). These were inserted into an expression vector and the strength of wild-type and codon optimised tat and gag gene expression compared in Western blot. For the gag vector, codon optimisation was shown (by co- transfection with GFP and using a p24 ELISA) to result in an 800-fold increase in expression.