Identifizierung neuer Zielgene im Indian-Hedgehog Signalweg

Abstract

Die Knochenentwicklung bei Vertebraten beginnt während der Embryonalentwicklung. Die meisten Knochen entstehen auf dem Weg der endochondralen Ossifikation. Hierbei kondensieren aus mesenchymalen Vorläuferzellen Chondrozyten. Diese proliferieren und differenzieren zu hypertrophen Chondrozyten, die schließlich durch Knochen ersetzt werden. Dieser Mechanismus der Knochenbildung findet postnatal bis zur Schließung der Wachstumsfuge statt und wird bei der Heilung von Knochenbrüchen reaktiviert. Ein wichtiger Signalfaktor, der sowohl die Differenzierung als auch die Proliferation und Knocheninduktion kontrolliert, ist der sekretierte Signalfaktor Indian-Hedgehog (Ihh). Frührere Studien haben gezeigt, daß die Kontrolle der Chondrozytendifferenzierung durch Ihh im Rahmen des Ihh/PTHrPRückkopplungs- kreises kontrolliert wird. Dabei reguliert Ihh durch die Induktion von Parathyroid Hormone related peptide (PTHrP) die Differenzierung von Chondrozyten zu hypertrophen Chondrozyten und ist proportional zur Menge der sich differenzierenden Chondrozyten exprimiert. Ziel dieser Arbeit war es, frühe Zielgene von Ihh zu identifizieren. Es konnte erstmals gezeigt werden, daß durch Cyclopamin eine Blockade des Ihh- Signalweges in der Kultur embryonaler Mausgliedmaßen erreicht wird. Diese Blockade führt zu einer ausbleibenden Induktion von PTHrP und einer verstärkten Differenzierung. Die Stimulation des Ihh-Signalweges wurde mit rekombinantem Shh-Protein erreicht. Auf dieser Grundlage wurde ein Screen nach Ihh-Zielgenen mit PCR-basierter subtraktiver Hybridisierung durchgeführt. Es wurden 60 Gene für die Aktivierung und 74 Gene für die Inhibition des Ihh- Signalweges gefunden. Von diesen 134 Klonen zeigten 32 ein chondrozytenspezifisches Expressionsmuster. Über die Transkriptquantifizierung dieser 32 Kandidaten mittels RNAse-Protection Assay konnten zwei Gene identifiziert werden, die in Antwort auf eine Inhibition des Ihh-Signalweges herabreguliert werden. Beide Gene werden von Ihh-defizienten Mäusen nicht exprimiert. Darüberhinaus zeigen Ihh-überexprimierende Mäuse eine Aktivierung der Expression dieser Gene in ihren Gliedmaßenanlagen. Eines der gefundenen Gene kodiert für Legumain, eine Cystein-Endopeptidase. Aufgrund des Expressionsmusters, das teilweise mit dem von Ihh überlappt, ist es möglich, daß Legumain ein negativer Regulator des Ihh-Signalweges ist. Weiterhin wird Legumain im Knochen exprimiert. Dies läßt auf eine unterstützende Rolle bei der Deposition der Knochenmatrix in dieser Region schließen. Das zweite Gen konnte einer neuen Genfamilie zugeordnet werden, die sich durch die computerannotierte Domäne unbekannter Funktion 590 (DUF 590) auszeichnet. Die Analyse der murinen EST-Datenbank ergab eine Transkriptsequenz von 5,9 kb mit einem offenen Leserahmen von 2727 Basen, entsprechend 909 Aminosäuren. Der Locus für dieses Gen konnte identifiziert werden. Er liegt auf dem Mauschromosom 15 in der Bande 15E3. Der Genlocus erstreckt sich über 185 kbp und umfaßt 20 Exons sowie ein alternatives Exon. In dieser Arbeit wurde ein neuer methodischer Ansatz zur effektiven Inhibition des Ihh-Signalweges etabliert. Die darauf aufbauende Identifikation von zwei neuen Zielgenen ist die Grundlage für ein tiefergehendes Verständnis des Ihh-Signalweges.

In vertebrates bone development begins during embryonic development. There are two ways how bone can develop: one is termed desmal ossification and the other one is termed endochondral ossification. During endochondral ossification chondrocytes condense from mesenchymal progenitors. These chondrocytes then begin to proliferate and differentiate into hypertrophic chondrocytes, which are later replaced by bone. An improtant signalling-factor, which controls the differentiation, the proliferation and the bone induction is Indian-Hedgehog (Ihh). Previous studies showed that the pace of chondrocyte differentiation is controlled by the Ihh/PTHrPfeedback loop. In this feedback loop the amount of Ihh represents the amount of differentiating condrocytes. Aim of this work was to identify early target genes of Ihh. A method to modulate the Ihh-signaling pathway in limb-culture efficiently has been established. Ihh-Signaling could be effectively inhibited by Cyclopamine. Based on this a subtractive cDNAscreen has been carried out. In this approach 60 candidates for the activation and 74 candidates for the inhibition of the Ihh-Signaling pathway have been initially identified. 32 of these 134 clones showed a chondrocyte- specific expression pattern. By RNAseprotection assay two of these 32 genes have been positively identified to be downregulated after the inhibition of the Ihh-signaling pathway. Additionaly these candidates did not show any chondrocyte specific expression pattern in Ihh-deficient embryos. In Ihh- overexpressing mice an activation of these candidates could be proofed. One of the candidates is Legumanin a cystein endopeptidase. The expression pattern of Legumain which partially overlaps with Ihh makes an modulation of Ihh- Signaling by Legumain possible. The second identified transcript was assigned to a new genefamily. This gene is expressed in the periost and bone. The common motive of this new gene-family is the annotated Domain of unkown function 590 (DUF590). The transcript was identified by creating an EST-contig of 5,9 kb. The ORF in this transcript was 2727 bases long, coding for a protein of 909 amino-acids. The gene-locus was located on mouse chromosome 15q, band 15E3. The covered genomic region by this gene spans 205 kbp and consists of 20 exons and one alternatively spliced exon. In this work a new methodic approach for the effective inhibition of the Ihh-signaling pathway has been established. The identification of two new target in the Ihh- signaling pathway gives new insights how the signal is transduced.