Entwicklung einer innovativen diagnostischen Technik unter Verwendung der xMAP®Luminex®Technologie für die simultane Detektierung von Antikörper gegen Cooperia oncophora, Dictyocaulus viviparus und Fasciola hepatica in bovinen Serum und Milchproben

Abstract

For the diagnosis and the identification of C. oncophora, D. viviparus and F. hepatica, coproscopical, molecular and serological techniques are available. For standard diagnosis, mainly coproscopical and serological methods are currently used. The sensitivity and specificity of the different techniques are extremely variable. Serological assays have the advantage of their implementation as herd health monitoring tools. All currently available assays are only capable of diagnosing Abs against one parasite and particularly serological assays are often limited in their specificity due to the use of complex crude or ES Ags. A high-throughput multiplex fluorescence immunoassay was successfully developed for the simultaneous detection of Abs produced against C. oncophora, D. viviparus and F. hepatica in bovine serum and milk (individual and BTM) samples. It is characterised by low costs and time, high reproducibility and more importantly, by high sensitivity and specificity, due to the use of recombinant Ags. The platform was furthermore characterised by absence of cross-reactivity with other important GI nematodes of livestock (e.g. H. contortus, O. ostertagi and T. colubriformis) when examined with positive sera from experimentally infected calves. Future examination of positive control serum samples from animals specifically mono-infected with other parasite species, such as Taenia saginata, Paramphistomum cervi etc. is envisaged. The conduction of one assay (in a 96-well format) can be performed in three hours, which is less or similar than those times usually needed for the performance of a classical ELISA. This multi-plex, multi-well format allows performance of large-scale epidemiological studies. Validation of the newly developed platform for both kinds of samples was performed using established, commercially available ELISAs that have been widely applied in the field. Correlation between the assays was good, especially when the same recombinant Ags were used. Since this platform is modular, it on one hand enables inclusion of other parasite species e.g. O. ostertagi, H. contortus, important biomarkers and herd health parameters in the future or on the other hand exclusion of individual target species for farms where these species are irrelevant in order to limit the costs. In particular, inclusion of O. ostertagi should be a major aim for the future, though recombinant Ag suitable for diagnosis are currently not available. Finally, the newly developed serum triplex Luminex assays was used to analyse field serum samples collected in Denmark, Switzerland and Poland. The results obtained show no or low rates of lungworm infection in all three countries. C. oncophora appears in higher rates in Poland in comparison to Denmark and Switzerland. Additionally in Poland, increased levels of liver fluke were detected. The first use of this technique in a field survey following the collection of BTM samples from four European countries (Belgium, Germany, Ireland and Poland) revealed generally high exposure to C. oncophora and considerably less exposure to D. viviparus. For F. hepatica the situation was slightly different with two countries (Ireland and Poland) showing high exposure rates and the other two more moderate Further optimisation of the assay (e.g. determination of positive cut-off values), ones. the inclusion of more paired samples from endemic and non-endemic areas is envisaged in the future.

Für die Diagnose und auch Identifikation von C. oncophora, D. viviparus und F. hepatica sind sowohl koproskopische, molekulare als auch serologische Methoden verfügbar. In der Routinediagnostik kommen hauptsächlich koproskopische und serologische Methoden zum Einsatz. Die Sensitivität und Spezifität der verschiedenen Methoden ist jedoch extrem unterschiedlich. Serologische Verfahren haben den Vorteil, daß man sie relative einfach in der Überwachung des Gesundheitszustandes von Herden einsetzen kann. Allen momentan verfügbaren Verfahren is jedoch gemeinsam, daß sie jeweils nur Antikörper gegen einen bestimmten Parasiten detektieren und außerdem, aufgrund der Verwendung von komplexen Ganzwurm-Antigenen oder exkretorisch-sekretorischen Antigenen, hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität limitiert sind. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte erfolgreich ein fluoreszens-basiertes Multiplex- Verfahren mit hoher Proben-Durchsatzzahl für die Bestimmung von Antikörpern gegen C. oncophora, D. viviparus und F. hepatica in bovinen Serum- und Milchproben (Einzelproben und Tankmilchproben) entwickelt werden. Dieses neue Verfahren zeichnet sich einerseits durch den geringen Kosten- und Zeitaufwand pro Probe und andererseits durch seine gute Reproduzierbarkeit, Sensitivität und Spezifität (durch die Verwendung rekombinanter Antigene) aus. Desweiteren war das Ausbleiben von Kreuzreaktionen mit anderen wichtigen Nematoden von Weidetieren (z.B. H. contortus, O. ostertagi und T. colubriformis) charakteristisch, was sich durch Untersuchung von Seren definiert-infizierter Kälber zeigte. Die Untersuchung von möglichen Kreuzreaktionen mit anderen Parasitenarten wie Taenia saginata, Paramphistomum cervi etc., ist bezüglich der weiteren Validierung anzustreben. Die Durchführung einer Platte (im 96-well Format) kann in drei Stunden durchgeführt werden, was kürzer oder genauso lang ist wie die Zeit, welche für die Durchführung eines klassischen ELISAs benötigt wird. Durch die gleichzeitige Untersuchung auf mehrere Parasiten ermöglicht dieses multi-plex/multi-well Format somit die Durchführung größerer epidemiologischer Studien. Die Validierung des neuen Verfahrens für beiden Probenarten, Serum und Milch, wurde durch die parallele Untersuchung der Proben in kommerziell erhältlichen, zugelassenen ELISAs erreicht. Die Korrelationen waren im Ganzen gut, insbesondere dann, wenn das gleiche rekombinante Antigen verwendet wurde. Da diese Multiplex-Plattform modular aufgebaut ist, ermöglicht es sowohl den zukünftigen Einschluß anderer Parasitenarten (z.B. O. ostertagi, H. contortus) als auch anderer wichtigen Biomarker oder Gesundheitsparameter. Insbesondere der Einschluß von O. ostertagi sollte ein wichtiges Ziel in der Zukunft sein, auch wenn es zur Zeit keine geeigneten Antigene für die Diagnose dieses Parasiten gibt. Genauso können auch bestimmte Parameter weggelassen werden wenn diese auf bestimmten Betrieben keine Rolle spielen um somit Kosten senken zu können. Das neue Triplex-Serum Verfahren wurde abschließend für die Untersuchung von in Dänemark, der Schweiz und Polen gesammelten Serumproben angewandt. Die erzielten Ergebnisse zeigen nur gering oder keine Antikörpertiter gegen D. viviparus in allen drei untersuchten Ländern. C. oncophora scheint in Polen häufiger vorzukommen als in Dänemark und der Schweiz. Außerdem wurden in Polen mehr erhöhte Antikörpertiter gegen F. hepatica detektiert.