Metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons by the microbiome of the human skin

Abstract

The bacterial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) as environmental contaminants is well described, as is the oxidative formation of potentially toxic intermediates. This led to the hypothesis of commensal PAH- metabolism and, potentially toxification. The skin is the organ most exposed to PAHs. However, the respective metabolism of skin-bacteria has not been investigated and is thus not considered during hazard or risk assessment. Using B[a]P as a model substance this project therefore aimed at elucidating the potential role of the skin’s microbiome with hindsight to PAH-toxicity. Carbon-limited enrichment cultures showed microbial B[a]P-metabolism to occur ubiquitously, yielding a total of 21 isolates. Phylogenetic analysis identified the corresponding organisms as common skin commensals. All isolates use B[a]P as sole source of carbon and energy and degradation was found to be complete as well as partial. In addition, several isolates were found to also grow on other PAHs such as pyrene or fluoranthene. It further appears that degradation of B[a]P can proceed via different metabolic pathways. The formation and excretion of toxic metabolites was observed for at least three organisms. One is a complete degrader, the other two metabolise B[a]P partially. The respective bacterial culture supernatants showed strong cytotoxic and genotoxic effects when added to human skin or liver cells. For the complete degrader this cytotoxic effect was transient, with the excretion of toxic intermediates being restricted to a time interval of 20-30 hours. In contrast late exponential supernatants of the partial degraders remained cyto- and genotoxic. Analytical approaches identified a mixture of synergistically operating metabolites. These comprise typical eukaryotic B[a]P-diols and B[a]P-diones as well as newly identified bacterial metabolites. The latter consist of 5-, 4- and 3-ring systems and include hydroxylated and unmodified B[a]A, Phe-4-CO2H and a B[a]P-diol. There are also qualitatively identified B[a]P-diols and B[a]A-diols. Bacterial supernatants increase the gene expression of typical monooxygenases of phase I metabolism in eukaryotic skin and liver cells. This is being consonant with the activity of the aryl hydrocarbon receptor. The receptor is important for the activation of further toxification and detoxification reactions. AHR shows a constitutive nucleocytoplasmic shuttling behaviour getting more pronounced while binding of endo- and exogenous ligands. The administration of the physiological functions of the AHR are regulated by a fine tuned regulatory system. Therefore different N-terminal as well as newly identified C-terminal domains are involved in the regulation of the nucleocytoplasmic AHR shuttling. This domains control ligand-induced and constitutive translocation processes of the AHR. Thereby, for the first time, the molecular background of the time resolved regulation of AHR could be elucidated. Furthermore, this work was able to show bacterial PAH degradation on the human skin by typical skin commensals. Resulting in a set of secreted cyto- and genotoxic metabolites. Preexisting daily exposure of human skin to PAHs as well as a possible penetration of these metabolites leads to high-risk potential for human carcinogenesis.

Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde erstmalig am Beispiel des kanzerogenen B[a]P untersucht, ob und in welchem Umfang das menschliche Hautmikrobiom PAKs metabolisiert und inwieweit sich daraus Bedenken für den Wirt ergeben. Ausgehend von Hautabstrichen unterschiedlicher Probanden wurden 21 verschiedene B[a]P-abbauende Bakterien isoliert und hinsichtlich ihres B[a]P-metabolisierenden Potenzials untersucht. Identifiziert wurden vorwiegend typische Hautkommensalen, wobei der Abbau von B[a]P als alleinige Kohlenstoff- und Energiequelle vollständig oder partiell erfolgte. Daten zur Biochemie deuten dabei auf die Existenz mehrerer verschiedener Abbauwege hin, während Substrattests zeigen, dass außer B[a]P auch andere hochmolekulare PAKs verwertet werden können. Dabei bildet ein Teil der Organismen während des Abbaus Intermediate, die ausgeschieden werden und in zellulären Assays auf Humanzellen stark zytotoxisch und genotoxisch wirken. In diesem Zusammenhang deuten sowohl die bakteriellen Wachstumsraten als auch die Toxizitätstests auf ein 20-30 stündiges Exkretionsfenster für die toxischen Metabolite hin. Mittels unterschiedlicher analytischer Methoden konnte gezeigt werden, dass es sich bei den ausgeschiedenen Intermediaten um ein synergistisch wirkendes Gemisch von bereits aus dem eukaryotischen Stoffwechsel bekannten hydroxylierten B[a]Ps und B[a]P-Dionen, sowie bisher unbekannten typisch bakteriellen Intermediaten handelt. Letztere reichen von 3- bis zu 5-Ringsystemen und umfassen unter anderem hydroxyliertes und nicht- hydroxyliertes B[a]A, Phe-4-CO2H und ein bisher nicht näher identifizierbares B[a]A-diol, sowie qualitativ identifizierte B[a]P-ole und B[a]A-diole. Vergleichende Toxizitätsstudien mit bakteriellen Überständen und Mischungen der identifizierten Metabolite belegen, dass weitere zyto- und genotoxische Intermediate exkretiert werden, die bisher nicht identifiziert werden konnten. Anhand der bakteriellen Überstände ist erkennbar, dass Monooxygenasen des Phase I-Stoffwechsels, über den AHR aktiviert werden um weitere Giftungs- und Entgiftungsreaktionen in der Zelle zu aktivieren. Zur Ausübung der Funktionalität besitzt der AHR ein fein austariertes regulatorisches System des nukleocytoplasmatischen shuttlings. Verschiedene N-terminale, sowie neu identifizierte C-terminale Bereiche sind maßgeblich an der Regulation einer basalen Translokation sowie eines Liganden gestützten shuttling durch exogene (β-NF, PAKs, PCBs¬) und endogene Liganden (Kynurenin, mikrobielle Tryptophan- und Indolderivate) beteiligt. Damit wurde ein wichtiger Beitrag zu den molekularbiologischen Hintergründen der Aktivität des AHR und der Regulation seiner Funktionen aufgezeigt. Des Weiteren zeigt diese Arbeit erstmals, dass der bakterielle Abbau von PAKs am Beispiel des B[a]Ps auf der Haut existiert. Durch die Sekretion zytotoxischer, als auch genotoxischer Metabolite stellt das humane Hautmikrobiom somit bei gegebener Exposition gegenüber PAKs, sowie gegebener Penetration ein Risiko für den Menschen dar.