Overexpression of Pyruvate, Orthophosphate Dikinase Facilitates Phosphate Uptake and Allows Better Growth of Tobacco in Alkaline Soil

Abstract

Phosphorus (P) is an essential nutrient for plant growth and reproduction. Lack of P causes problems in agricultural production. P concentration is low in soil compared with other nutrients. In alkaline soil, P forms unavailable compounds for plant uptake. To alleviate this, millions of tons of P are applied every year. Up to 80% of the applied P fertilizer is lost because it becomes unavailable for plant uptake. Therefore, the development of more efficient plant varieties to use P represents the best alternative to reduce use of P fertilizers, and achieve more sustainable agriculture. Pyruvate, Orthophosphate dikinase (PPDK) is an enzyme that catalyzes the interconversion of ATP, Pi, and pyruvate with AMP, PPi, and phosphoenolpyruvate (PEP). Some studies reported enhance activity of PPDK in plants under abiotic stress, like absence of P. Others reported that overexpression of PPDK increased exudation level of organic acid, and enhanced the tolerance of plants to Al-stress. Organic acids play an important role in mobilizing the insoluble P and make it available for plant uptake. Transgenic tobacco plants expressing plastidic (PPDK) or cytosolic (ΔPPDK) M. crystallinum PPDK, under the control of B33 and CaMV-35S promoters were studied. Several physiological parameters were measured. Both the transgenic and wild-type plants grown in absence or presence of P, behaved similar in each of them (absence / presence of P). Interestingly, we found remarkable differences in most of the collected data from HAp treatment concerning the transgenics compared with the wild-type, where the growth of the transgenic plants in HAp was better compared with the wild-type. The transgenics increased exudation of organic acids, accumulated more biomass, and their content of P was significantly higher than that of the wild-type. The transgenic seedlings grown in solid MS medium containing HAp, significantly produced less root:shoot ratio compared with the wild-type. Transgenic seedlings acidified the growth medium in the presence of HAp better than that of wild-type. Furthermore, production of secondary root of transgenic seedlings in HAp was more in number and length than that of wild- type. Surprisingly, the transgenic seedlings content of P in HAp and Pi+ was similar, and significantly higher than that of wild-type. Growth of transgenic plants in alkaline soil was further studied. They strongly reduced the pH of the soil, grew significantly better and fruited successfully. In contrast, wild-type plants grown in the same soil, showed only a little acidification and the growth was strongly restricted. Moreover, they failed to flower. Whole seedlings and shoot samples of both transgenic and wild-type showed an increase in their content of citric and malic acid in Pi- compared with those in HAp and Pi+. PPDK enzyme plays an anaplerotic role in the replenishment of intermediates of the citric acid cycle. The overexpression of PPDK leads to enhance the metabolism of organic acids. The better growth of transgenics that overexpress PPDK is related to their ability of high amount of organic acid exudation to the soil, which enhances the availability of P for plant uptake.

Phosphor (P) ist ein wichtiger Nährstoff für Pflanzen und essentiell für Wachstum und Reproduktion. Phosphormangel führt zu Problemen in der landwirtschaftlichen Produktion. Im Vergleich zu anderen Nährstoffen ist die P-Konzentration im Boden niedrig. In alkalischen Böden bildet P Verbindungen, die nicht pflanzenverfügbar sind, weshalb jährlich in der Landwirtschaft Millionen Tonnen Phosphor-Dünger ausgebracht werden. Bis zu 80% des P geht verloren, da er nicht mehr für die Aufnahme durch Pflanzen verfügbar ist. Daher ist die Entwicklung von Pflanzensorten mit effizienterer P-Aufnahme die beste Alternative um den Einsatz von Phosphor-Düngemitteln zu reduzieren und eine nachhaltigere Landwirtschaft zu gewehrleisten.Pyruvat, Orthophosphat Dikinase (PPDK) ist ein Enzym, das die Umwandlung von ATP, Pi und Pyruvat zu AMP, PPi und Phosphoenolpyruvat (PEP) katalysiert. Einige Studien zeigten auf, dass es einen Anstieg in der Aktivität von PPDK in Pflanzen unter abiotischen Stressbedingungen wie Abwesenheit von P. gibt. In anderen wurde berichtetet, dass die Überexpression von PPDK zu einer erhöhten Exsudation organischer Säuren und somit zu gesteigerter Toleranz der Pflanzen gegen Al-Stress führt. Organische Säuren spielen eine wichtige Rolle bei der Mobilisierung des unlöslichen P und somit dessen Zugänglichkeit für Pflanzen.Es wurden transgene Tabakpflanzen untersucht, die plastidäre (PPDK) oder cytosolische (ΔPPDK) M. crystallinum PPDK unter der Kontrolle von B33- und CaMV-35S-Promotoren exprimieren. Es wurden mehrere physiologische Parameter gemessen. Die transgenen Pflanzen und der Wildtyp haben sich sowohl in Anwesenheit (Pi+) als auch in Abwesenheit (Pi-) von löslichem P gleich verhalten. Interessanterweise fanden wir deutliche Unterschiede in den meisten der gesammelten Daten zur HAp-Behandlung beim Vergleich der transgenen Pflanzen und des Wildtyps. In HAp war das Wachstum der transgenen Pflanzen besser als das des Wildtyps. Die transgenen Pflanzen hatten eine erhöhte Exsudation von organischen Säuren, akkumulierten mehr Biomasse und ihr Gehalt an P war signifikant höher als im Wildtyp. Die transgenen Keimlinge, die in festem MS-Medium mit HAp gewachsen sind, hatten ein deutlich geringeres Wurzel-Sprössling-Verhältnis als die Keimlinge des Wildtyps. Transgene Sprösslinge haben in Gegenwart von HAp das Wachstumsmedium besser angesäuert als die des Wildtyps. Darüber hinaus war die Anzahl und Länge der sekundären Wurzeln bei den transgenen Keimlingen in HAp höher als beim Wildtyp. Überraschenderweise war der P-Gehalt in den transgenen Keimlingen in HAp und Pi+ ähnlich und deutlich höher als beim Wildtyp.Das Wachstum von transgenen Pflanzen in alkalischen Böden wurde weiter untersucht. Sie haben den pH-Wert des Bodens stark verringert, wuchsen deutlich besser und haben Blüten gebildet. Im Gegensatz dazu zeigte der Wildtyp, der in dem gleichen Boden wuchs, nur eine geringe Versauerung und das Wachstum war stark eingeschränkt. Darüber hinaus gab es keine Blütenbildung. Proben der Jungpflanzen und Sprösslinge sowohl von den transgenen Pflanzen als auch vom Wildtyp zeigten eine Zunahme in ihrem Gehalt an Zitronen-und Äpfelsäure in Pi- im Vergleich zu denen in HAp und Pi +. Interessanterweise zeigten Wurzelproben von transgenen Pflanzen und vom Wildtyp einen Rückgang von Zitronen-und Äpfelsäure in Pi-und HAp im Vergleich zu Pi +. PPDK spielt eine Rolle in der anaplerotischen Aufstockung der Intermediate des Citratzyklus. Die Überexpression von PPDK führt zu einer Verbesserung des Stoffwechsels organischer Säuren. Das bessere Wachstum transgener Pflanzen, die PPDK überexprimieren hängt mit ihrer Eigenschaft zusammen, große Mengen organischer Säuren in den Boden abgeben zu können, was die Verfügbarkeit von P für die Pflanze erhöht.