Untersuchungen zur Struktur und Funktion von Cytomegalovirus - kodierten Fc- gamma-Rezeptoren

Abstract

Das Gen m138 des Maus Cytomegalovirus (MCMV) kodiert für ein Glykoprotein, welches den Fc Teil von IgG bindet und auf der Zelloberfläche von infizierten Zellen lokalisiert ist und daher einen virus-kodierten Fc gamma-Rezeptor bildet. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass m138 Homologe von Cytomegaloviren der Ratte (RCMV) gleichfalls diese Eigenschaft besitzen und somit Fc gamma-Rezeptoren darstellen. Um weitere Aussagen über die Struktur des m138 Glykoproteins treffen zu können, wurde ein Sequenzvergleich mit den RCMV kodierten Homologen, sowie der zellulären Fc gamma-Rezeptoren CD16, CD32 und CD64 durchgeführt. Aus den sich ergebenden Homologien wurde ein hypothetisches Modell des MCMV kodierten Fc gamma- Rezeptors entwickelt, in dem die Fc gamma Bindung durch drei putative Immunoglobulinsupergenfamilien (IgSF)-artige (Ig) Domänen vermittelt werden könnte. IgSF Domänen werden typischerweise durch Disulfidbrücken, die durch zwei positionskonservierte Cysteine ausgebildet werden, strukturell stabilisiert. Veränderungen in der Sekundärstruktur sollten ein verändertes Fc gamma-Bindungsverhalten zu Folge haben. Um die hypothetische Sekundärstruktur des m138 experimentell untersuchen zu können, wurden die positionshomologen Cysteine systematisch mutagenisiert und durch Alanin ersetzt. Das Einfügen der Punktmutationen wurde durch PCR Mutagenese und Klonierung dieser Produkte in verschiedene Vektoren realisiert. Rekombinante Vaccinia Viren wurden zur Prüfung der Fc gamma Bindung der m138 Mutanten durch Durchflusszytometrie und Fc gamma Präzipitation verwendet. Parallel dazu wurden die gleichen Punktmutationen mittels BACmid Mutagenese ins MCMV Genom eingeführt, um eine anschließende in vivo Analyse in der Maus zu ermöglichen. Es konnte gezeigt werden, dass sich bei den verschiedenen Punktmutationen die Fc gamma- Bindungsfähigkeit in unterschiedlicher Intensität ändert. Der erwartete dominante Einfluss der generierten Punktmutationen auf die Fc gamma Bindungsfähigkeit von m138 konnte nicht gezeigt werden.

Mouse cytomegalovirus (MCMV) m138 encodes for a surface resident glycoprotein that binds the Fc gamma part of IgG, thus constituting a viral Fc gamma receptor (Fc gamma R). In this dissertation it is shown for the first time that m138 homologues of rat cytomegaloviruses (RCMV) encode also for an Fc gamma binding glycoprotein. To gain deeper insight into the structure of the m138, glycoprotein sequence alignments with gene homolog’s of RCMV and cellular Fc gamma Rs of the mouse, i.e. CD16, CD 32 and CD64 were performed. From the resulting homologies a hypothetical model of MCMV encoded Fc gamma R was developed in which Fc gamma binding is mediated by 3 putative immunoglobulin supergene family (IgSF) like-domains. These IgSF domains are characterized by 2 positionally conserved cysteins, stabilizing the protein structure through disulphide bonds. Changces in the secondary structure should lead to a modified Fc gamma binding capability. To validate the hypothetical secondary structure of m138, in a comprehensive approach positionally conserved cysteins were replaced by alanin. The construction of the point mutants was achieved by PCR mutagenesis and subcloning of the resulting products into different vectors. Recombinant vaccinia viruses were used for testing point mutants for Fc gamma bindung in cytofluorometry and protein precipitation. In parallel the point mutants were integrated to the MCMV genome via BACmid based mutagenesis to allow future in vivo analysis in the mouse. It could be demonstrated that the some of the point mutants exhibited a loss of Fc gamma binding capabilities at various intensities. However the expected strong effect of the generated point mutants on the Fc gamma binding could not demonstrated.