Untersuchung der Expression und Translokation von Transkriptionsfaktoren bei der Aktivierung von T-Helfer- und regulatorischen T-Zellen

Abstract

Die Regulation der IL-2 Expression ist während einer Immunantwort von außerordentlicher Bedeutung für die Balance des Immunsystems, weil IL-2 nicht nur die T-Zell-Aktivierung und die Entwicklung von Effektorfunktionen fördert, sondern zudem grundlegend zur Homöostase und Funktion von regulatorischen T (Treg) -Zellen beiträgt. Die Transkriptionsfaktoren NFATc2, NF-κB und AP-1 (c-fos und c-jun) müssen nach Stimulation kooperativ an den IL-2-Promotor binden, um die Genexpression zu induzieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst die IL-2 Expression in Abhängigkeit der Mengen dieser Transkriptionsfaktoren untersucht. Hier zeigte sich, dass Gedächtnis-Th- Zellen, die IL-2 produzieren, signifikant mehr NFATc2 und c-fos exprimieren als die Gedächtnis-Th-Zellen, die kein IL-2 exprimieren. Die Expression von c-jun und NF-κB hingegen unterscheidet sich nicht signifikant. Die Einzelzellanalyse der Transkriptionsfaktoren zusammen mit IL-2 verdeutlicht zudem, dass die c-fos- und NFATc2-Mengen limitierend für eine binäre Produktion von IL-2 sind. Treg-Zellen werden anhand des Transkriptionsfaktors FOXP3 charakterisiert. Bislang wurde angenommen, dass sie grundsätzlich kein IL-2 produzieren können. Ob dafür die verminderte Expression oder Defekte in der Aktivierung der Transkriptionsfaktoren NFATc2, NF-κB und AP-1 verantwortlich sind, wurde im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Mit Hilfe der durchflusszytometrischen Detektion aktivierter Transkriptionsfaktoren zusammen mit FOXP3 in isolierten Zellkernen wurde gezeigt, dass NFATc2, AP-1 und NF-κB in Treg-Zellen voll aktivierbar sind. Die Gesamtexpression der Transkriptionsfaktoren hingegen, unabhängig vom Aktivierungsstatus, ist in Treg- deutlich geringer als in Gedächtnis-Th-Zellen. Mit Hilfe von Chromatin- Immunopräzipitationen wurde die direkte Bindung von FOXP3 an den NFATc2-Promotor in unstimulierten Treg-Zellen aufgezeigt. Somit scheint FOXP3 selbst zur Hemmung der NFATc2 Expression in Treg Zellen beizutragen. Überraschenderweise wurden nach in vitro Stimulation Treg-Zellen detektiert, die entgegen der Annahme IL-2 produzieren. Diese wiederum exprimieren mehr NFATc2 und AP-1 (vergleichbar mit der Expression in Gedächtnis-T-Zellen), aber weniger FOXP3 als die IL-2 nichtproduzierenden Treg-Zellen. NF-κB jedoch ist nicht differentiell exprimiert. Diese Daten unterstützen die Hypothese, dass die IL-2-Produktion von den Mengen und Verhältnissen von NFATc2, c-fos und FOXP3 abhängig ist. Diese Abhängigkeit konnte teilweise mit Hilfe eines mathematischen Modells reproduziert werden. Da Th-Zellen von Patienten, die an Autoimmunerkrankungen wie Systemischen Lupus Erythematodus (SLE) leiden, kaum IL-2 exprimieren können, ist das Verständnis der molekularen Mechanismen, die zur Regulation der IL-2 Expression beitragen, von großer Bedeutung für potentielle Therapien z.B. mit exogenem IL-2 oder anti-IL-2 Antikörpern.

The regulation of IL-2 expression in Th-cells is of great importance for the balance of the immune system, because IL-2 not only mediates inflammatory responses but also the function and homoeostasis of regulatory T (Treg)-cells. NFATc2, NF-κB and AP-1 (c-fos and c-jun) have to bind to the IL-2 promoter cooperatively to induce IL-2 expression. Here, the dependence of the IL-2 expression in human memory Th-cells on the amounts of these transcription factors was determined. Flow cytometric analysis of the transcription factors and IL-2 in single cells shows a significantly higher expression of NFATc2 and c-fos in IL-2-producing than in –nonproducing memory Th-cells. On the contrary, NF-κB and c-jun are not differentially expressed. Moreover, single- cell analysis and subsequent statistical analysis enabled us to show that the amounts of NFATc2 and c-fos are limiting factors for the binary IL-2 expression in memory th-cells. Treg-cells characteristically express the master transcription factor FOXP3 and should not be able to express IL-2. Therefore, we investigated whether the lower expression or defects in the activation of NFATc2, NF-κB and AP-1 could account for their inability to produce IL-2. The activation of all three transcription factors, analyzed by flow cytometric measurement of isolated nuclei, is intact. But their expression, independent of the activation status, is very low in Treg- compared to memory Th-cells. For the low NFATc2 amount, Chromatin- Immunoprecipitation revealed the binding of FOXP3 to the NFATc2-promotor in unstimulated Treg-cells, indicating that FOXP3 itself represses the constitutive NFATc2 expression. After in vitro stimulation we surprisingly found a small population of Treg-cells that produces IL 2. These cells showed a higher expression of NFATc2 and AP-1 (comparable to memory Th-cells) but lower FOXP3 amounts than IL-2-nonproducing Treg-cells. The expression levels of NF-κB, however, was unchanged. These results favor the hypothesis, that the ratios and amounts of NFATc2, AP-1 and FOXP3 in Treg cells are crucial for the induction of IL-2 expression in Treg-cells, which has also been reproduced by a mathematical model based on the single cell data on transcription factor expression. Since IL-2 production is highly impaired in Th-cells from patients suffering from autoimmune diseases such as Systemic Lupus Erythematosus (SLE), a better knowledge of the molecular mechanisms and factors regulating IL-2 expression is important for potential therapeutic manipulations such as treatment with exogenous IL-2 or anti-IL-2 antibodies.