Immunreaktionen gegen HPV-positive und -negative Kopf-Hals-Tumore und ihre Stammzellen

Abstract

Die tumorantigen- (TA) spezifische Immuntherapie könnte eine wichtige ergänzende, schonende und effektive Behandlungsalternative gegen Tumore generell und speziell von Plattenepithelkarzinomen im Kopf-Hals-Bereich (KH- PECA) darstellen. Als Grundlage für zielgerichtete Immuntherapien von KH-PECA, untersuchte ich, ob a) durch Selbst- und HPV-Antigene, eine antitumorale T-Zellantwort hervorgerufen wird, b) ob im Tumor Zellen mit Tumorstammzell- (TSZ) Eigenschaften vorkommen und c) ob eine gegen TSZ gerichtete T Zellantwort nachweisbar ist. Die Mehrheit humaner Karzinome, einschließlich der KHPECA, zeigt eine p53-Überexpression. Für letztere konnten wir eine natürliche anti-Wildtypp53-TA-spezifische CD8+ T-Zellantwort mit signifikanter Anreicherung in der Tumormikroumgebung nachweisen. Zugleich zeigten immunsuppressive regulatorische T Zellen in tumorinfiltrierenden Lymphozyten eine signifikante Anreicherung. Ihre Präsenz trägt wahrscheinlich zu der geringen Antitumorreaktivität der TA-spezifischen CD8+ T-Zellen in situ bei. Hinzu kommen weitere vom Tumor stammende Faktoren, die zu der Dysfunktion von Effektor-T-Zellen beitragen und zu der von uns nachgewiesenen stark erhöhten Apoptoserate von anti-Wildtyp-p53-TA-spezifischen T-Zellen führt. Diese könnte Ausdruck des bei Tumorpatienten beobachteten hohen Lymphozytenumsatzes sein. Immunsuppressive Mechanismen könnten besonders relevant für Wildtyp-p53-TA sein, da es sich hierbei um Selbstantigene handelt, für die ein gewisses natürliches Toleranzniveau zu erwarten ist. Neben p53-TA stellen bei Humanem Papillomavirus- (HPV) assoziierten KH-PECA von diesem Virus stammende antigene Proteine Ziele für Antitumorvakzine dar. Die Häufigkeit und Reaktivität von HPV16-E711-20 und -E786-93-spezifischen T-Zellen bei Patienten mit HPV+ und -negativen KH-PECA wurde bestimmt. Bei allen Patienten mit HPV16+ Tumoren war die Frequenz von T-Zellen dieser beiden Spezifitäten signifikant erhöht, und sie zeigten einen terminal differenzierten degranulierten Phänotyp. Trotz Expression des entsprechenden HLAKlasse-I-Allels konnten TA-spezifische zytotoxische T-Zellen (ZTL) eine natürlich HPV16-transformierte KH-PECA- Zelllinie erst nach Vorbehandlung mit Interferon- (IF) γ lysieren. Weitere Untersuchungen an der Zelllinie zeigten geringe oder keine Expression für die Antigenprozessierung und -präsentation (APP) wichtige Komponenten, die jedoch durch IF-γ oder Transfektion von APP-Komponenten rekonstituiert werden konnte. Analog hierzu zeigten immunhistochemische Untersuchungen an HPV+ KH-PECA eine herabregulierte Expression von APP-Komponenten und HLA. Antitumorvakzine zur Behandlung von HPV+ KH-PECA müssen also eine effektive T-Zellantwort und Expression von APP-Komponenten stimulieren um Tumorimmun-escape entgegenzuwirken. Das Ausbleiben klinischer Erfolge durch Immuntherapien warf die Frage auf, ob sich die stimulierte T-Zellantwort gegen die richtige Zellpopulation des heterogenen Tumors richtet. Initiation, Wachstum, Rezidivierung und Metastasierung von KH-PECA werden TSZ zugeschrieben, die durch ihre Aldehyddehydrogenase-1- (ALDH1) Expression identifiziert werden können. Alle getesteten KH-PECA-Linien bildeten Spheroide und Kolonien mit erhöhter ALDH1-Expression, die sich selbst erneuern und serienpassagiert werden konnten. Weiterhin konnten wir eine signifikante Erhöhung von embryonalen Transkriptionsfaktoren und von EMT-Markern bei gleichzeitiger Verminderung von Adhäsionsmolekülen nachweisen. Funktionell, mit diesem mobilen Phänotyp übereinstimmend, zeigten diese Zellen Zeichen von EMT und eine erhöhte Invasivität. Um die Bedeutung der ALDH1-Expression in vivo zu untersuchen, haben wir 40 Primärtumor-Metastasenpaare, die zur Hälfte HPV+ waren, analysiert und die Daten mit klinischen Parametern korreliert. Die ALDH1-Expression war in Metastasen unabhängig vom HPV-Status signifikant erhöht. In HPV+ Primärtumoren fanden sich signifikant weniger ALDH1+ Zellen. Tumore mit erhöhter ALDH1-Expression waren durch einen aggressiveren Tumorphänotyp mit höherem Metastasierungsgrad und geringerer Differenzierung charakterisiert. Die Ergebnisse suggerieren unabhängig von der Ätiologie und dem ALDH1-Anteil das Vorhandensein einer ALDH1+ Tumorzellsubpopulation, die die metastatische Kaskade zu komplettieren kann. Vorbereitend auf klinische Studien haben wir die Empfindlichkeit von TSZ gegenüber alloantigen- (AA) spezifischer CD8+ ZTL-Lyse untersucht. Die MHC-I-Expression war bei TSZ in einer von drei getesteten Zelllinien herabreguliert. Durch eine Stimulation mit IF-γ konnte die Expression von MHC-I und CD54 heraufreguliert werden. TSZ zeigten sich gegenüber Lyse mit AA-spezifischen CD8+ ZTL resistenter als die parentalen Zelllinien. Eine Behandlung mit IF-γ führte jedoch zu überproportionaler Lyse von TSZ. Die Untersuchung der ALDH+ Population zeigte, dass stark ALDH+ Zellen empfindlicher gegenüber ZTL-Lyse waren als die niedrig ALDH+ Population. Hieraus wird deutlich, dass es eine natürliche Immunantwort gegen TA von KHPECA gibt, die jedoch unterschiedliche Ausprägungen von Immun- escape vor ZTL zeigen. Dies erklärt u.a. das bisherige Ausbleiben durchschlagender Therapieerfolge durch T-Zell-Immuntherapie. Eine Ursache mag sein, dass diese Therapien auf die falsche Tumorzellpopulation abzielten. Wir konnten demonstrieren, dass den TSZ und der EMT bedeutsam für die Unterhaltung, das Wachstum und die Metastasierung von KH-PECA sind, und sie nach Vorbehandlung mit IF-γ durch ZTL abgetötet werden können. Bei der Entwicklung zukünftiger ZTL-basierter Antitumorvakzine sollte eine Berücksichtigung dieser Erkenntnisse zu höherer Wirksamkeit führen.

Tumor-antigen (TA) specific immunotherapy could be an important supplementary, gentle and effective alternative treatment for malignancies in general and specifically for squamous cell carcinomas of the head and neck area (HNSCC). As basis for targeted immunotherapy of HNSCC, we investigated a) if an anti- tumor T cell response is triggered by self- or HPV derived antigens, b) if in the tumor cells with cancer stem cell (CSC) properties are present and c) if a CSC-targeted T-cell response is present. The majority of human carcinoma including HNSCC overexpress p53. For the latter we could demonstrate a natural anti-wildtype-p53-TA-specific CD8+ T cell response with significant enrichment in the tumor environment. Simultaneously, immunosuppressive regulatory T cells were significantly increased. Their presence contribute probably to the relatively low anti-tumor reactivity of TA-specific CD8+ T cells in situ. In addition other tumor derived factors contribute to the dysfunction of effector T cells and, as demonstrated by us, to the high apoptotic rate of anti- wildtype-p53-TA-specific CD8+ T cells. This could be one of the reasons of the high lymphocyte turnover rate observed in cancer patients. Immunosuppressive mechanisms could be relevant for anti-wildtype-p53-TA since they are self- antigens and for these antigens a certain level of natural tolerance can be expected. Apart from p53-TA, in human papillomavirus (HPV) associated HNSCC antigenic proteins derived from this virus may serve as targets for anti-tumor vaccines. The frequency and reactivity of HPV16-E711-20 and -E786-93-specific T cells of patients with HPV+ and –negative HNSCC was determined. The frequency of T cells of both specificities was increased in all patients with HPV16+ tumors and the T cells displayed a terminally differentiated degranulated phenotype. Despite expression of the respective HLA-class-I allel TA-specific cytotoxic T cells (CTL) could lyse a naturally HPV-transformed cell line after interferon (IF) - γ pre-treatment. Further investigation of this cell line showed little or no expression of important components of the antigen-processing and –presentation machinery (APM). However these expressions could be reconstituted by IF-γ or transfection of APM-components. Accordingly immunohistochemistry of HPV+ HNSCC showed down-regulated APC- components and HLA. Therefore anti-tumor vaccines for the treatment of HPV+ HNSCC should stimulate an effective T cell response and expression of APM- components to prevent immune-escape. The scarcity of clinical successes raised the question if the stimulated T cell response aims at the right population of the heterogeneous tumor. Initiation, growth, recurrence and metastasis of HNSCC are attributed to CSC that can be identified by their expression of aldehyd-dehydrogenase-1 (ALDH1). All tested cell lines generated spheroids and colonies with increased ALDH1 expression that could self-renew and be serial- passaged. Moreover, we could demonstrate a significant increase of embryonic transcription factors and EMT-markers while molecules important for adhesion were reduced. Functionally, matching this mobile phenotype the cells showed signs of EMT and increased invasiveness. To investigate the relevance of ALDH1 expression in vivo we analyzed 40 paired samples of primary tumors and corresponding metastases and correlated the results with clinical parameters. One half of the samples were HPV+. The ALDH1-expression was in metastases independently of the HPV-status increased. In HPV+ primary tumors significant less ALDH1+ cells were present. Tumors with increased ALDH1+ expression were characterized by a more aggressive phenotype with lower differentiation and a higher grade of metastasis. These results suggest independent of the etiology and the ALDH1-content that the presence of an ALDH1+ subpopulation able to complete the metastatic cascade. In preparation of clinical studies we have tested the susceptibility of CSC to alloantigen- (AA) specific CD8+ CTL-lysis. The MHC-I-expression was in CSC in one of three tested cell lines down- regulated. By stimulation with IF-γ expression of MHC-I and CD54 could be up- regulated. CSC were more resistant to AA-specific CD8+ CTL lysis then the parental cell line. However treatment with IF-γ resulted in over proportionally increased lysis of CSC. The investigation of the ALDH+ population showed that cells with strong ALDH expression were more susceptible to CTL-lysis than cells with low expression. Clearly a natural immune response to HNSCC derived TA exists however the cells display different grades of immune-escape from CTL. This explains the lack of success seen in T cell based immunotherapies. One reason for this may be that therapies so far targeted the wrong cancer cell subpopulation. We could demonstrate that CSC and EMT are important for the maintenance, growth and metastasis of HNSCC and that after pre-treatment with IF-γ these cells can be killed by CTL. For the development of future CTL-based anti-tumor vaccines this insight should lead to increased effectiveness.