Peptidgenerierung durch das Proteasom: Untersuchung des Einflusses der T210M Substitution im gp100209-217 Tumorepitop auf die Antigenprozessierung

Abstract

Das 20S Proteasom ist als multikatalytische Protease für die Degradation von zellulären Proteinen verantwortlich und entscheidend an der Prozessierung MHC Klasse I-restringierter tumorspezifischer Peptide (Tumorepitope) beteiligt, die an der Zelloberfläche zytotoxischen T-Zellen (CTLs, cytotoxic T lymphocytes) präsentiert werden. Voraussetzung für die Aktivierung der CD8+ T-Zellen ist die spezifische Erkennung und Interaktion des T-Zell-Rezeptors (TCRs) an der Oberfläche der T-Zelle mit dem Peptid-MHC-Komplex auf Tumorzellen. Somatische tumorspezifische Mutationen können zu einer auf den Tumor beschränkten Veränderung der Aminosäuresequenz und infolgedessen zur Entstehung neuer, tumorspezifischer Epitope (Neoepitope) beitragen. Derartige somatische Mutationen sind insbesondere dann therapeutisch interessant, wenn sie die MHC Klasse I-Bindungsaffinität eines antigenen Peptids erhöhen und so die Erkennung durch TCRs optimieren. Der Erfolg einer adoptiven T-Zell- Therapie hängt dabei stark von der effizienten Generierung solcher Neoepitope durch das Proteasom ab. Die vorliegende Arbeit untersucht den Einfluss eines Aminosäureaustausches am Beispiel einer Substitution von Threonin gegen Methionin an Position 210 (T210M) im HLA-A*02:01-restringierten GlucoProtein(gp) 100209-217 Tumorepitops aus Melanomazellen auf die Antigenpräsentation. Zunächst wurde die Bedeutung dieses Aminosäureaustausches innerhalb des Tumorepitops auf das Spaltverhalten des Proteasoms untersucht. Bei der massenspektrometrischen Analyse der proteasomal generierten Spaltprodukte zeigten sich zwischen dem tumorassozierten Wildtyp (wt) und dem mutierten (mut) gp100201-230 Polypeptid qualitative als auch quantitative Unterschiede. Der T210M Austausch führte zur Generierung eines neuen, spezifischen Peptidpools, der neue, potenziell antigene Peptide mit einer guten theoretischen MHC Klasse I-Bindungsaffinität enthielt, und verbesserte die Menge an proteasomal prozessiertem Neoepitop bzw. dessen N-terminal verlängerten Vorläuferpeptiden. Untersuchungen zur Bindung des substituierten gp100209-217 (T210M) Epitops an die MHC Klasse I-Protein-Komplexe und Antigenpräsentationsanalysen mit antigenspezifischen CD8+ T-Zellen zeigten sowohl eine verbesserte Bindungsaffinität als auch eine erhöhte CD8+ T-Zell- Stimulation durch das T210M mut gp100209-217 im Vergleich zum wt gp100209-217 Epitop. Im Gegensatz dazu hatte der T210M Aminosäureaustausch im Tumorepitop keinen relevanten Einfluss auf das Trimmverhalten der Endoplasmatischen Retikulum residenten Aminopeptidase I (ERAP I), die für die N-terminale Verkürzung der proteasomal gebildeten Vorläuferpeptide zum minimalen Epitop verantwortlich ist. Zusammenfassend zeigen die in vitro Untersuchungen, dass es durch einen einzigen Aminosäureaustausch von Threonin zu Methionin innerhalb der Sequenz des HLA-A*02:01-restringierten gp100209-217 melanomen Tumorepitops zur Generierung eines veränderten, potenziell immunrelevanten Peptidpools durch das Proteasom kommt. Die Epitop-spezifische CD8+ T-Zellantwort wird aufgrund der verbesserten proteasomalen Prozessierung des Tumorepitops bzw. dessen N-terminal verlängerter Vorläuferpeptide verstärkt.

The 20S proteasome a multi-catalytic protease, is responsible for degradation of most cellular proteins. It plays a key role in the generation of MHC class-I restricted tumour-specific epitopes that are presented on the cell surface to cytotoxic T cells (CTLs, cytotoxic T lymphocytes). A prerequisite for the activation of CD8+ T cells is the specific recognition and the interaction of T cell receptors (TCRs) on the cell surface with the MHC- peptide complex. Somatic tumour-specific mutations can contribute to alterations in the amino-acid sequence of an antigen and can result in the formation of new, tumour-specific epitopes (neo-epitopes). Such mutations are of therapeutic interest when they enhance the MHC class-I binding affinity of an epitope and in turn, potentially optimize the recognition by TCRs. The success of adoptive T cell therapy strongly depends on the efficient generation of neo-epitopes by the proteasome. This study examines the influence on antigen presentation of a threonine to methionine substitution at position 210 (T210M) in the HLA-A*02:01-restricted gp100209-217 melanoma tumour epitope. At first, the relevance of the T210M exchange was investigated with respect to its influence on the cleavage site usage of the proteasome. Mass-spectrometric analysis of the proteasome-generated fragments disclosed qualitative as well as quantitative differences between the tumour-associated wild type (wt) and the mutated (mut) gp100201-230 polypeptide. The T210M exchange resulted in the generation of a new, specific peptide pool that contained potentially antigenic peptides with good theoretical MHC class-I binding affinity. It also led to an enhancement of the amount of the proteasome-generated neoepitope and its N-terminally extended precursor- peptides. Analysing the binding of the neo-epitope to the MHC class-I protein complexes, and antigen presentation analyses using gp100209-217 specific CD8+ T cells, demonstrated an enhanced binding affinity of the mutant peptide as well as an increased CD8+ T cell stimulation by the mut gp100209-217 in comparison to the wt gp100209-217 epitope. In contrast, the T210M exchange in the tumour epitope had no relevant influence on the trimming behaviour of the endoplasmic reticulum-resident aminopeptidase I (ERAP I), responsible for N-terminal shortening of the proteasome-formed precursors to the minimal epitope.