Metabolomics - New biomarkers for early detection of immunosuppressive-induced nephrotoxicity and chronic rejection after KTX: a translational analysis from animal model to kidney transplant patients

Abstract

This dissertation investigated biochemical profiles to develop new metabolic biomarkers for early detection of immunosuppressive - induced nephrotoxicity and chronic rejection. An animal trial with 256 healthy Lewis rats was established and the results were translated to a prospective clinical trial with 48 de novo kidney transplanted patients. Lewis rats were randomly assigned to treatment groups (n=4/group). All rats were treated with immunosuppressants administered by oral gavage once daily for 28 days. The study used a control group and three different doses of a calcineurin and mTOR inhibitor in every possible combination (n=4/ dose combination). After 28 days, blood, urine and tissues were collected for analysis. For clinical trial, after transplantation, patients were started on standard immunosuppressive drugs consisting of a calcineurin inhibitor, steroids, mycophenolate mofetil (MMF/MPA) and an induction therapy (Basiliximab). 14 ml of blood and 10 ml of urine samples were collected from each patient at fixed time-points before and on days 1, 3, 7 and on months 1, 3, 6, 9 and 12 after transplantation. Renal allograft biopsies were performed as part of the routinely applied diagnostic workup in the case of graft dysfunction (proteinuria and/or an increase in creatinine). The aim of this dissertation was to win some results by the translational analysis from animal model to transplant patients for developing new specific biomarkers. The overall hypothesis was that kidney transplant function is reflected by metabolite changes in plasma and urine. To test this hypothesis, I carried out a translational project to evaluate: A) Effects induced by immunosuppressants in kidney metabolism in the rat as reflected by changes in urine metabolite patterns. B) Changes induced in kidney metabolism by different immunosuppressants and their combinations (CyA/Tac in combination with Evrl or Srl). Furthermore the following questions were asked: 1) Can changes in urine metabolite pattern predict changes in kidney function and kidney injury (immunosuppressant nephrotoxicity and/or rejection) with better sensitivity than the currently established clinical biomarkers typically used to monitor and manage kidney transplant patients such as GFR, serum creatinine concentrations and histological changes in biopsies? 2) Is it possible to predict the clinical outcome in a transplant patient population by assessing these novel biomarkers? To answer the hypothesis the animal model showed that A) Urinary metabolites after 28 days of exposure to immunosuppressants were mainly hippurate, creatinine, glucose, succinate, citrate, alpha ketoglutarate, and trimethyl aminooxide (TMAO) Isoprostanes were not changed after 28 days of exposure. B) When combined with calcineurin inhibitors, everolimus had a less negative effects on urine metabolite patterns compared to sirolimus. The histology scores showed mild and not statistifically significant alterations in different immunosuppressant treatment doses. 1) There was no association between drug blood concentrations and biopsy-proven alloimmune or immunosuppressant nephrotoxicity. As already indicated by the rat studies, isoprostanes in urine and plasma seem to be more of an acute marker rather than a marker for long-term monitoring of renal transplant patients. 2) In a next step the human urine metabolites and their immunosuppressant induced changes should be analyzed and put in relation to the animal study results. Initial clinical data based on this dissertation suggested in the animal model that these biomarkers are more sensitive and predictive than creatinine in serum. These biomarkers will now have to be qualified in larger prospective clinical trials for the early detection of immunosuppressant-induced nephrotoxicity.

Die vorliegende Arbeit untersuchte biochemische Profile zur Detektierung metabolischer Biomarker, die zur Früherkennung von immunsuppressions- induzierter Nephrotoxizität und chronischer Rejektion genutzt werden sollen. Dazu wurde eine Tierstudie mit gesunden Lewis-Ratten etabliert und dessen Ergebnisse in einem zweiten Schritt in einer prospektiven klinischen Studie mit 48 de novo nierentransplantierten Patienten auf den Menschen übertragen. 256 Lewis Ratten wurden willkürlich einer Behandlungsgruppe zugeordnet (n=4). Alle Ratten wurden oral mit Immunsuppressiva einmal am Tag für 28 Tage behandelt. Die Studie benutzte drei verschiedene Dosen der Calcineurin- und mTor-Inhibitoren in jeder möglichen Kombination (n=4/Dosiskombinationen) sowie eine Kontrollgruppe. Nach 28 Tagen wurde Blut, Urin und Gewebe für die Analysen gesammelt. Für die klinische Studie wurde nach der Transplantation mit der standardisierten Immunsuppressionsgabe begonnen, in Form von einem Calcineurininhibitor, Steroiden, MMF/MPA und einer zusätzlichen Induktionstherapie (Basiliximab). 14ml Blut und 10ml Urin wurden von jedem Patienten an bestimmten Fixpunkten gesammelt: Vor und am Tag der Transplantation, an Tag 1,3,7 sowie in den Monaten 1,3,6,9 und 12 nach der Transplantation. Nierenbiopsien wurden als Teil der Routinediagnostik im Fall der Transplantatdysfunktion (Proteinurie und/oder Kreatininanstieg) durchgeführt. Das Ziel meiner Dissertation war es durch die Translationsanalyse vom Tier auf den Menschen Erkenntnisse zu gewinnen, die bei der Entwicklung neuer spezifischer Biomarker eine fruchtbare Rolle spielen. Es wurde die These aufgestellt, dass die Nierentransplantatfunktion bei Mensch und Tier durch spezifische metabolische Veränderungen im Plasma und im Urin zu erkennen sind. Diese Hypothese wurde anhand des Tiermodels und der klinischen Studie getestet, um A) die Wirkung der Immunsuppressiva auf den Nierenstoffwechsel der Ratte durch die Veränderungen in den Urinstoffwechselmustern sichtbar zu machen. B) Unterschiede in den Veränderungen im Nierenstoffwechsel aufzuzeigen, die in Relation zu den verschiedenen Kombinationsmöglichkeiten der Immunsuppressiva stehen (CyA und Tac in Kombination mit Evrl oder Srl). Außerdem sollten folgende Fragen beantwortet werden: 1) Können die Veränderungen in den Metabolitmustern im Urin herangezogen werden, um die Nierenfunktion bei Nierenerkrankungen (immunsuppressive Nephrotoxizität und/oder Rejektion) mit besserer Sensitivität aufzuzeigen, als die derzeitig etablierten Marker, wie GFR, Serumkreatinin und histologische Biopsie? 2) Ist es möglich durch diese neuen Biomarker das klinische Outcome einer nierentransplantierten Patientenpopulation vorauszusagen? Aus dem Tierversuch ließ sich folgendes zur Beantwortung der Hypothese ableiten: A) Die Urinmetabolite, die sich nach 28 Tagen durch die Exposition mit Immunsuppressiva veränderten, waren : Hippurat, Kreatinin, Glukose, Succinat, Citrat, Alpha- Ketoglutarat und TMAO. Die Isoprostane zeigten sich unverändert nach der Exposition über 28 Tage. B) In der Kombination mit den Calcineurininhibitoren hatte Everolimus einen deutlich weniger toxischen Effekt als Sirolimus. Die Histologien zeigten milde und nicht statistisch signifikante Veränderungen in den unterschiedlichen Behandlungsdosen. 1) Die Ergebnisse der klinischen Studie erlaubten keinen signifikanten Rückschluss auf eine Assoziation zwischen den Blutspiegeln und der durch Biopsie geprüften Nephrotoxizität. Die Isoprostane scheinen aufgrund ihrer vermuteten Anpassungsfähigkeit, wie schon im Tiermodell angedeutet, mehr ein akuter Marker, als für ein Langzeitmonitoring von Nierentransplantierten geeignet zu sein. 2) In einem weiteren Schritt sollten die kompletten humanen Urinmetabolite und deren Veränderung durch die Immunsuppression untersucht und in Relation zur Tierstudie gestellt werden. Die in einem ersten Versuch in dieser Dissertation durchgeführte Translationsanalyse zeigte im Tiermodell, dass die neuen Biomarker sensitiver und spezifischer sind, als der derzeitige Goldstandard Kreatinin. Die Biomarker sollten nun in größeren prospektiven klinischen Studien weiter untersucht werden um eine bessere Möglichkeit zur Früherkennung von immunsuppressionsinduzierter Nephrotoxizität beim Menschen zu erlangen.