Kompensationsmechanismen im Skelettmuskel von neuronaler Stickstoffmonoxid- Synthase (nNOS) defizienten Mäusen

Abstract

In Skelettmuskelfasern wird das Signaltransduktionsmolekül Stickstoffmonoxid (NO) in hohen Konzentrationen durch die am Sarkolemm verankerte neuronale NO Synthase (nNOS) produziert. Aus der Literatur ist bekannt, daß die nNOS an verschiedenen physiologischen Prozessen im Skelettmuskel beteiligt ist. So kann der oxidative Stoffwechsel durch nNOS-Aktivität auf verschiedenen Stufen gedrosselt werden, indem enzymatische Reaktionen (in der Glykolyse und der Atmungskette) blockiert, die Muskelkontraktion abgeschwächt oder die Glucoseaufnahme gesteigert werden. Außerdem vermag nNOS-produziertes NO als Vasodilatator die Perfusion der Endstrombahn des Skelettmuskels zu erhöhen. nNOS-knockout-Mäuse zeigen jedoch keine phänotypischen Veränderungen im Skelettmuskel. Daher wurde in dieser Studie nach differentiell exprimierten Proteinen gesucht, die den Verlust der nNOS im Skelettmuskel kompensieren könnten. Von ungefähr 800 erfassten Spots nach zweidimensionaler Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE) waren sieben differentiell exprimiert. Ihre Identität wurde durch LC-MS/MS aufgeklärt. Peroxiredoxin-6 war nur im EDL von nNOS-knockout-Mäusen nachzuweisen. Prohibitin, Peroxiredoxin-3, Cu2+/Zn2+-Superoxid-Dismutase, Heat shock protein beta-1, eine nicht näher charakterisierte Form von Myoglobin sowie Nukleotiddiphosphat Kinase B waren im EDL von nNOS-knockout-Mäusen höher konzentriert als im EDL von C57-Mäusen. Darüber hinaus wurde die Identität von Peroxiredoxin-6 im EDL der nNOS-knockout-Mäuse durch Immunblotting verifiziert. Durch quantitative Echtzeit-RT-PCR wurde gezeigt, dass Peroxiredoxin-6, Peroxiredoxin-3, Cu2+/Zn2 +-Superoxid-Dismutase auch auf mRNA-Ebene im EDL der nNOS-Maus hochreguliert sind, während Myoglobin herunterreguliert ist. Da die nNOS an der Vasodilatation im Skelettmuskel beteiligt ist, wurden die Konzentrationen von anderen vasomodulatorischen Proteinen im EDL der beiden Mausstämme durch quantitatives Immunoblotting vergleichend ermittelt. Dabei zeigte sich, dass es keine offensichtlichen Unterschiede in der Proteinkonzentration der endothelialen eNOS, der induzierbaren iNOS und der Hämoxygenase (HO)-1 zwischen der C57-Maus und der nNOS-knockout-Maus gibt. Demgegenüber wurde eine starke immunreaktive HO-3-Bande in EDL-Homogenaten von nNOS-knockout-Mäusen gefunden, die in EDL-Homogenaten von C57-Mäusen nicht nachzuweisen war. Prohibitin, Peroxiredoxin-6, Peroxiredoxin-3, Cu2+/Zn2+-Superoxid dismutase, Heat shock protein beta-1 und Nukleotiddiphosphat Kinase B sind in der Literatur als Enzyme beschrieben, die reaktive Sauerstoffintermediate (ROS) beseitigen können. Ihre Heraufregulation, insbesondere die von Peroxiredoxin-6 zur Kompensation der nNOS-Defizienz, deutet darauf hin, dass die Hauptfunktion des nNOS-generierten NO weniger die Regulation des Skelettmuskelstoffwechsels oder des Vasotonus als vielmehr der Abbau von Sauerstoffradikalen ist.

Neuronal nitric oxide synthase (nNOS), by whose action the gaseous signalling molecule nitric oxide (NO) is produced, exists at high concentrations in the skeletal muscles of mammals. Targeting to the sarcolemma is mediated mainly by its N-terminal PDZ domain, which facilitates the integration of nNOS into the dystrophin glycoprotein complex. Many functions have been attributed to nNOS within skeletal muscle. In contracting skeletal muscles of the rat limb, the raised levels of nNOS –derived NO promote relaxation. Furthermore, NO supports the uptake of glucose by muscle fibres during contraction. Other investigations indicate that nNOS plays a role in the cGMP-dependent relaxation of smooth muscle cells in skeletal muscle, thereby aiding eNOS- facilitated vasodilation. Although nNOS is involved in pivotal physiological processes in many tissues, a loss of tissue weight is the only skeletal muscle-associated alteration in nNOS-knockout mice. To our opinion, this change in macroscopic phenotypic appears to be rather mild with respect to the various important functions assigned to nNOS in skeletal muscle. Thus, we hypothesize the existence of adaptive mechanisms that functionally compensate for the absence of nNOS in skeletal muscle. To identify proteins that might be involved in adaptive responses in skeletal muscle of knockout mice lacking nNOS, 2D-PAGE with silver-staining and subsequent tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was performed using extracts of extensor digitorum longus muscle (EDL) derived from nNOS-knockout mice in comparison to C57B1/6 control mice. Seven proteins were significantly (p≤0,05) more highly expressed in EDL of nNOS-knockout mice than in that of C57 control mice, all of which are involved in the metabolism of reactive oxygen species (ROS). These included prohibitin (2,0-fold increase), peroxiredoxin 3 (1,9-fold increase), Cu2+/Zn2+-dependent superoxide dismutase (1,9-fold increase), heat shock protein ß-1 (1,7-fold increase), nucleoside diphosphate kinase B (2,6-fold increase) and myoglobine (2,7-fold increase). A significantly higher expression of peroxiredoxin 6 (not detectable in C57 mice) in the EDL of nNOS-knockout mice were confirmed by quantitative immunoblotting. The concentrations of the mRNA encoding five of these proteins (the exception being myoglobine and prohibitin) were likewise significantly (p≤0,05) higher in the EDL of nNOS-knockout mice. Although many vasodilator substances have been described to be involved in the regulation of vascular tone in skeletal muscle, only a higher expression of hemeoxygenase 3 (not detectable in C57 mice) in the EDL of nNOS-knockout mice were confirmed by immunoblotting. We suggest that the up-regulation of proteins that are implicated in the metabolism of ROS, particularly of peroxiredoxin 6, within skeletal muscle of nNOS-knockout mice functionally compensates for the absence of nNOS in scavenging of ROS.