Involvement of human fibroblasts in adipose tissue development

Abstract

Human adult somatic stem cells, residing in almost every human tissue, have currently attracted attention due to their multipotent abilities, and those of the skin due to their easy access. Fibroblasts, cells of mesodermal origin and major structural cells of the dermis, have been over decades regarded as “terminally differentiated” cells. More recently, dermal fibroblasts were shown to possess multilineage potential, giving rise to fat-, cartilage- and bone-like cells in numerous experiments. On the other hand, many authors continue to believe that fibroblasts do not possess such differentiation potential, although fibroblasts have been reported to be capable to differentiate into adipocytes. However, it has been disputed whether these adipocytes, indeed, derive from fibroblasts or from progenitor cells that reside in the dermis. Nevertheless, it still remains unclear whether fibroblasts, an easily accessible cell population, without being transformed into induced pluripotent cells, can themselves serve as a pool of multidynamic cells with universal – rather than isolated - cell plasticity. The aim of my thesis was to investigate the differentiation capacity of human dermal fibroblasts, specifically towards an adipogenic phenotype and to establish a method, which makes it possible to pbtain satisfactory numbers of adipocytes from differentiated human primary skin fibroblasts. These cells could be used in therapeutic needs in regenerative medicine, for example in cases of extended lipodystrophy (facial rehabilitation in HIV-positive patients, steroid-induced lipoatrophy, scleroderma), as well as in scientific cosmetic dermatology to fill voids (skin ageing or rare genetic diseases, such as progeria syndromes). Furthermore, the differentiation capacity of dermal fibroblasts from young donors versus older ones was assessed. Moreover, the gene expression profile of adipogenic induced fibroblasts was conducted in order to gain insight into the transcriptional phenotype of differentiated cells and to map important molecular pathways during the differentiation process. Primary fibroblasts were obtained from skin specimens of human foreskin and of the light-protected area of the inner upper arm of 30– and 76-year old women. An adipocyte induction system was applied and lipid accumulation and cell morphology in induced and control fibroblasts was analysed by fluorescence microscopy, flow cytometric analysis (FACS) and transmission electron microscopy. Lastly, after the induction towards an adipogenic lineage, the transcriptional phenotype of the cells was determined via microarrays and compared with that of control cultures and genuine adipose tissue. The time-related expression levels of a comprehensive group of adipocyte-specific genes were further assessed by a sensitive real-time RT- PCR. My results suggest that under special culture conditions, human dermal fibroblasts are able to accumulate intracellular lipids and to acquire an adipocyte-like morphology and transcriptional phenotype in vitro. This ability is stronger in cells derived from young skin in comparison to those derived from older skin. Fibroblasts from younger donors express a considerable amount of major transcription factors of adipogenesis, master regulatory genes, as well as adipocyte-specific genes. On the other hand, although adipogenesis is also initiated in fibroblasts from older donors, it is likely to remain incomplete. We conclude that dermal fibroblasts could be a suitable cell source for purposes of regenerative medicine, however younger donors should be preferred and regenerative treatments should be performed at early ages.

Aufgrund Ihrer multipotenten Fähigkeiten gelangten die erwachsenen humanen somatischen Stammzellen in den Fokus des wissenschaftlichen Interesse. Von besonderer Bedeutung sind hier die dermalen Stammzellen, da für diese eine einfache Entnahmemöglichkeit besteht. Fibroblasten sind Zellen mesodermalen Ursprungs und die Hauptstrukturzellen der Dermis. Sie werden als nahezu entdifferenzierte Zellen betrachtet. Es gab bislang wenige Berichte, dass Fibroblasten zu Adipozyten differenzieren können. Es konnte in bisherigen Experimenten nicht geklärt werden, ob diese Adipozyten von Fibroblasten oder Präadipozyten abstammen, welche eine Vorstufe der Adipozyten darstellen. Ziel des Projektes war die Etablierung einer Methode, um aus primären Fibroblasten menschlicher Haut eine größere Anzahl von Adipozyten zu erhalten und die experimentelle Überprüfung der Hypothese, dass sich primäre Fibroblasten menschlicher Haut in Adipozyten umwandeln können. Die induziertne Fibroblasten und daraus gewonnenen Adipozyten könnten sowohl für therapeutische Zwecke der regenerativen Medizin (z.B. in Zell- und Gewebetransplantation, Lipoatrophien bei HIV-positiv Patienten, steroid-induzierte Lipoatrophien, Sklerodermie) als auch für die wissenschaftliche kosmetische Dermatologie (z.B. Hautalterung oder bei Syndromen mit extremer, vorzeitiger Alterung der Patienten wie zum Beispiel dem Progerie-Syndrome) genutzt werden. Primäre Fibroblasten wurden aus humaner Vorhaut und aus lichtgeschützer Haut an der Oberarminnenseite von 30 und 76 Jahre alten Frauen gewonnen. Eine Induktion der Fibroblasten zu Adipozyten wurde durchgeführt und die Lipidspeicherung in den induzierten Fibroblasten mittels Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie und Elektronenmikroskopie beurteilt. Zuletzt wurde der transkriptionelle Phänotyp der Zellen bestimmt und mit Kontrollzellen (nativen Fibroblasten) und Fettgewebsadipozyten verglichen. Adipozytenspezifische Gene wurden mit real- time PCR und microarray Genanalyse untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass unter speziellen Kulturbedingungen kultivierte humane Hautfibroblasten fähig sind, zu Adipozyten-ähnlichen Zellen zu differenzieren. Diese Fähigkeit zur Differenzierung ist bei Fibroblasten von jüngeren Spenderinnen stärker als bei Fibroblasten von älteren Spenderinnen. „Junge“ sowie „alte“ Fibroblasten exprimieren nach der adipogenen Induktion eine signifikante Anzahl von wichtigen Transkriptionsfaktoren und regulatorischen Genen der Adipogenese, sowie Adipozyten-spezifischen Gene und Differenzierungsmarker. Allerdings exprimieren die induzierten „alten“ Fibroblasten eine kleinere Anzahl von Genen als „junge“ Fibroblasten mit schwächerer Expression als bei den „jungen“ induzierten Zellen. Zusammenfassend könnten dermale Fibroblasten eine geeignete Quelle für Zellen sein, die für Zwecke der regenerativen Medizin gebraucht werden. Jüngere Spender sollten hierbei bevorzugt werden und regenerative Behandlungen frühzeitig durchgeführt werden.