Inhibition RANKL-induzierter Differenzierung und Aktivierung humaner Osteoklasten durch MG-132, MG-262, Bortezomib und Curcumin

Abstract

Die Therapie osteolytischer Herde bei Tumorerkrankungen stellt noch immer eine Herausforderung für Arzt und Patient dar. Dabei führt der Abbau von Knochengewebe im Bereich der Wirbelsäule als Prädilektionsstelle zur Änderung der Stabilität des Körpers und der Gefahr der Schädigung des Rückenmarks. Folgen sind neben einem schwer beherrschbaren Schmerzsyndrom neurologische Defizite und Blasen-Mastdarmstörungen, die zu einer drastischen Reduktion der Lebensqualität führen. Der derzeitige pharmakologische Goldstandard liegt in der Anwendung von Bisphosphonaten, die zwar eine Reduktion der Knochenresorption durch Osteoklasten bewirken, jedoch nicht zu einer vollständigen Aufhebung der Osteoklastenaktivität führen. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Wirkung moderner Tumortherapeutika auf die Genese und Aktivität von humanen Osteoklasten. Analysiert wurden die Proteasominhibitoren MG-132, MG-262 und Bortezomib (PS-341, VELCADE®) sowie Curcumin. Zur Gewinnung humaner Präosteoklasten und Osteoklasten wurde gesunden Probanden peripheres Venenblut entnommen, aus dem die Selektion möglicher Osteoklastenvorläuferzellen innerhalb der Monozyten-Makrophagen-Linie erfolgte. Hierbei wurden die Adhäsionfähigkeit und die Expression des Oberflächenmarkers CD14 dieser Zellen genutzt. Die Stimulation von Wachstum und Resorption erfolgte mit Hilfe der Wachstumsfaktoren M-CSF und RANKL. Nach 28 Tagen Kultivierung wurde zur Auswertung der Osteoklastogenese/-differenzierung innerhalb der Kulturen die intrazellulär gelegene tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) angefärbt. Die Analyse der Aktivierung reifer Osteoklasten wurde durch Toluidinblaufärbung von Resorptionslakunen auf Elfenbeinchips erreicht. Die Bestimmung der NF-κB- aktivität erfolgte mittels p65-ELISA. Zur Klärung der Wirkungsmechanismen von Bortezomib und Curcumin erfolgte neben der Ermittlung der intrazellulären NF- κB-Aktivität die Expression von IκB-α- und phospho-IκB-α innerhalb der Zellen per Western Blot. Die Analyse des intrazellulären ROS-Spiegels unter Curucuminbehandlung erfolgte durch die Verwendung von 2’,7’-Dichlorofluoreszeindiacetat. Die Behandlungen mit MG-132, MG-262, Bortezomib und Curcumin zeigten eine signifikante Reduktion der RANKL- induzierten Osteoklastogenese und RANKL-induzierten Aktivierung von Osteoklasten. Alle hier verwendeten Testsubstanzen führten zur Hemmung der RANKL-induzierten NF-κB-Aktivierung. Die Analyse der IκB-α und phospho- IκB-α-Expression zeigte bei der Behandlung mit Bortezomib eine erhöhte Expression von phospho-IκB-α im Vergleich zur RANKL-stimulierten Positivkontrolle. Die Behandlung mit Curcumin führte, vermutlich basierend auf einer IKK-Hemmung, zu einer reduzierten Expression von phospho-IκB-α. Klinische Studien sind nun notwendig, um zu prüfen, ob die hier verwendeten Pharmaka zu einer Reduktion von Knochenmanifestationen bei malignen Erkrankungen mit Knochenmetastasen führen.

Treatment of cancer-induced lytic bone disease is still a challenge. Enhanced bone resorption may cause intractable bone pain, skeletal instability and spinal cord injury, which lead to a drastic reduction in quality of life. Currently, the gold standard of treatment is bisphosphonates, a group of pharmaceuticals that decrease but not abrogate osteoclast activity in human. PURPOSE: The purpose of this study was to investigate the hypothesized anti- osteoclastogenic effects of a group of agents with documented antitumor activity on human osteoclastogenesis. We analyzed the effects of proteasome inhibitors MG-132, MG-262 and bortezomib (PS-341, VelcadeTM) and the polyphenol curcumin in regard to differentiation and activation of human osteoclasts. MATERIAL AND METHODS: Preosteoclasts were derived from peripheral blood of healthy volunteers using the mononuclear cell fraction obtained by Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation. Targeted cells were then isolated by adhesion selection or by immunomagnetical selection of CD14-postive cells. For investigation of differentiation and activation of osteoclasts, the cells were stimulated by M-CSF and RANKL, in presence or absence of test agents, on plastic or dentine slices. After a culture period of 28 days, cells were stained with TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase), and dentine slices were stained with toluidine blue. For delineation of action of bortezomib and curcumin, we investigated their influence on the NF-κB-pathway by NF-κB (p65)-ELISA and phospho-IκB-α- / IκB-α western blot. To analyze changes in the production of reactive oxygen species (ROS) in osteoclasts during incubation with curcumin, we used 2’,7’-dichlorofluoresceindiacetat. RESULTS: Treatment with MG-132, MG-262, bortezomib and curcumin showed a significant reduction of RANKL-induced osteoclastogenesis and RANKL-induced activation of osteoclasts. All agents caused a reduction of RANKL-induced NF-κB-activation. Due to proteasome inhibition by bortezomib in osteoclasts a high level of intracellular phospho- IκB was recognized. Preincubation with curcumin showed a reduction of RANKL- induced phosphorylation of IκB, presumably through IKK-inhibition. CONCLUSION: Proteasome inhibition has anti-osteoclastogenic effects. Clinical studies have to reveal the influence of described agents on tumor-induced lytic bone disease in the clinical setting.