Untersuchung posttranslationaler Modifikationen des Transkriptionsfaktors Oct4 in humanen embryonalen Stammzellen

Abstract

Die Aufrechterhaltung der Pluripotenz in embryonalen Stammzellen (ESC) ist ein komplexer Prozess, der durch das Zusammenspiel verschiedener molekularer Regulationsmechanismen ermöglicht wird. Das Zentrum dieses regulatorischen Netzwerkes bildet ein Transkriptionsfaktorkomplex, bestehend aus Oct4, Sox2 und Nanog. Die Differenzierung der ESCs führt im Allgemeinem zu einem Expressionsverlust dieser Transkriptionsfaktoren. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass es im Verlauf der spontanen Differenzierung (nCM 3d) zu deutlichen morphologischen und molekularen Veränderungen der humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) kam, während sich die Expression des zentralen Transkriptionsfaktors Oct4 kaum veränderte. Aus diesem Grund wurde vermutet, dass posttranslationale Modifikationen, wie z. B. Proteinphosphorylierung die Funktion von Oct4 entscheidend beeinflussen. Mithilfe der zweidimensionalen Gelelektrophorese (2-DG) konnte ein möglicher Zusammenhang zwischen den differenzierungsassoziierten Veränderungen der hESCs und dem Oct4-Phosphorylierungszustand hergestellt werden. Mithilfe bioinformatischer Software wurde eine potentielle Proteinkinase A (PKA) Phosphorylierungsstelle in der Oct4 Aminosäuresequenz identifiziert. Durch in vitro Kinase Experimente konnte daraufhin bestätigt werden, dass es sich bei Oct4 um ein Phosphoprotein handelt. Die Modulation der PKA-Signaltransduktionskaskade und Punktmutationen des potentiellen PKA-Phosphorylierungsmotives bedingten eine Veränderung der Proteinauftrennung in der 2-DG. Als mögliche Konsequenz der Oct4-Phosphorylierung wurden veränderte DNA-Bindungseigenschaften von Oct4 nachgewiesen. Demnach wird die Oct4-DNA-Bindung durch die Phosphorylierung stabilisiert. Neben der differenzierungsabhängigen Dephosphorylierung von Oct4 konnte in einem Reprogrammierungsexperiment die essentielle Bedeutung der Oct4-Phosphorylierung bei der Induktion der Pluripotenz nachgewiesen werden. Anhand der in dieser Dissertation generierten Daten wurde ein Modell erstellt, in dem versucht wird, die potentielle Funktion der PKA-vermittelten Oct4-Phosphorylierung bei der Aufrechterhaltung der Pluripotenz und der spontanen Differenzierung zu erklären. Die in dieser Arbeit vorgenommenen Studien bieten somit neue Einblicke in den Regulierungsmechanismus von Oct4 während der spontanen Differenzierung der hESCs und zeigen des Weiteren eine direkte Verbindung zwischen der Phosphorylierung eines der zentralen Transkriptionsfaktoren der Pluripotenz (Oct4) und der Reprogrammierung somatischer Zellen in induzierte pluripotente Stammzellen.

The maintenance of pluripotency in embryonic stem cells (ESC) is a complex process that is mediated by the interaction of different molecular mechanisms. At the core of these molecular mechanisms lies the autoregulatory complex of the transcription factors Oct4, Sox2 and Nanog. In general differentiation of the ESCs is associated with the downregulation of these core transcription factors. In this study, we show that spontaneous differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) leads to morphological and molecular changes without a significant decrease in the expression of the core transcription factor Oct4. Therefore, we hypothesized that posttranslational modifications, such as protein phosphorylation, may decisively influence the function of Oct4. Using two-dimensional gel electrophoresis (2-DG) we established a possible link between the differentiation-associated morphological and molecular changes in the hESCs and the Oct4-phosphorylation state. Bioinformatic analysis identified in the amino acid sequence of Oct4, a putative protein kinase A (PKA) phosphorylation site, which was confirmed by in vitro kinase assays. Furthermore, modulation of the PKA signaling pathway and a point mutation of the potential PKA phosphorylation site caused a change in the Oct4 protein migration pattern in the 2-DG. Furthermore phosphorylation of Oct4 lead to a change in its DNA binding properties, suggesting that phosphorylation may stabilize Oct4 binding to DNA. Finally, we demonstrate that Oct4 phosphorylation not only influences the maintenance of pluripotency in hESCs, but is also important for the induction of pluripotency in somatic cells. The exact mechanism of how changes in Oct4 phosphorylation influence the global gene expression in these processes remains to be identified. In conclusion, our studies provide new insights into the regulatory mechanisms of the core transcription factor Oct4 and also provide a direct link between Oct4 phosphorylation events and somatic cell reprogramming. Furthermore, we propose a model, which describes the potential role of PKA-mediated Oct4 phosphorylation in maintaining pluripotency and during spontaneous differentiation.