Funktion und Expression von Plasticity Related Gene 3 und Lipid Phosphat Phosphatase 1 und 1a während der Gehirnentwicklung

Abstract

In den letzten Jahren gab es zunehmend Hinweise, dass bioaktive Phospholipide während der Gehirnentwicklung eine wichtige Rolle spielen. Extra- und intrazelluläre Phospholipidspiegel werden sowohl von Phospholipid- synthetisierenden als auch degradierenden Enzymen reguliert. In diesem Zusammenhang wurde im Rahmen dieser Arbeit der Einfluss von Proteinen der Familie der Lipid Phosphatasen/Phosphotransferasen, die an der Regulation des Phospholipidspiegels beteiligt sind, während der Gehirnentwicklung bzw. der Differenzierung von Neuronen am Beispiel von Plasticity Related Gene 3 (PRG3) und Lipid Phosphat Phosphatase 1 und 1a (LPP1 und 1a) untersucht. Plasticity Related Genes wurden vor einigen Jahren im Rahmen einer Untersuchung zur Entdeckung neuer Proteine identifiziert, die an Regenerationsprozessen im zentralen Nervensystem beteiligt sind. Über die Expression und Funktion von PRG3 ist bisher nur sehr wenig bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass PRG3 auf der zweiten extrazellulären Schleife am Asparagin 163 N-glykosyliert wird und dass diese N Glykosylierung einen Einfluss auf die Plasmamembranlokalisation und die PRG3-induzierte Filopodienbildung in vitro hat. PRG3 weist eine weitgehend gehirnspezifische Expression auf, mit der stärksten Expression in späten embryonalen und frühen postnatalen Stadien. Innerhalb des Gehirns konnte PRG3-Protein nur in Neuronen nachgewiesen werden. Des Weiteren deuten die Daten darauf hin, dass PRG3 während der neuronalen Entwicklung in vitro eine Rolle spielt: In frühen unreifen Neuronen ist PRG3 vor allem in der Plasmamembran sämtlicher Ausläufer lokalisiert, wobei die stärkste Expression in der Plasmamembran des Neuritenschafts auftritt. In reifen Neuronen wird PRG3 weitgehend axonal exprimiert und kommt hier unter anderem in präsynaptischen Strukturen vor. PRG3 könnte also eine spezifische Funktion wie z.B. die Stabilisierung, Wegfindung oder aktive Konsolidierung von Neuriten zukommen. Hierbei könnte PRG3 als Membranprotein nach Stimulation durch extrazelluläre Signale intrazelluläre Signalkaskaden aktivieren. Im Gegensatz zu PRG3 handelt es sich bei LPP1 und 1a um Proteine, die im Hinblick auf ihre biochemischen Eigenschaften in den letzten Jahren genauer untersucht wurden. Ihre Expression und Funktion im zentralen Nervensystem waren aber noch weitgehend unbekannt. Die im Rahmen dieser Arbeit erhobenen Daten zeigen, dass die Expression von LPP1 und 1a in Neuroblastomzellen einen Einfluss auf die Morphologie dieser Zellen hat. Darüber hinaus konnte eine Expression von LPP1 und 1a im Gehirn nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass LPP1 und 1a die radiale Migration kortikaler Neurone während der Embryonalentwicklung beeinflussen. Neurone mit einem LPP1/1a-Knockdown migrieren verspätet aus der (sub)ventrikulären Zone in Richtung kortikaler Platte. Auch innerhalb der kortikalen Platte führt der LPP1/1a-Knockdown zu einer im Vergleich zu den Kontrollen veränderten Lokalisation eines Teils dieser Neurone. Neurone mit einen LPP1/1a-Knockdown waren dabei vermehrt in den unteren kortikalen Schichten lokalisiert. Das Radialglia¬netzwerk, die neuronale Identität der transfizierten Zellen, die Proliferation und der Zellzyklus bleiben davon aber unberührt. LPP1/1a shRNA-transfizierte Neurone waren darüber hinaus sogar in der Lage, sich morphologisch ihrer Umgebung anzupassen. Es wird vermutet, dass die Funktion von LPP1 und 1a während der radialen Kortexmigration in der Regulation des extra- und/oder intrazellulären Phospholipidspiegels und der damit verbundenen Signaltransduktion zu suchen ist. Die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Erkenntnisse tragen dazu bei, die Funktionen von PRG3 und LPP1 und 1a während der Gehirnentwicklung bzw. der neuronalen Differenzierung genauer einzugrenzen. Die Aufklärung solcher Prozesse, die an der Entstehung und der Funktion des ZNS beteiligt sind, könnte zum Verständnis weiterer Ursachen angeborener Fehlbildungen des Gehirns führen.

Recently, evidence has been accumulating that phospholipids have a function during brain development. The extracellular and intracellular levels of these phospholipids are controlled by enzymes producing and/or degrading them. This study investigated the phospholipid-modifying enzymes plasticity related gene 3 (PRG3) and lipid phosphate phosphatases 1 and 1a (LPP1 and 1a) during brain development and neuronal differentiation to extrapolate on the influence of the lipid phosphatase/phosphotransferase family. Plasticity related genes have been found only recently during an investigation to identify proteins involved in regeneration processes in the brain. Therefore, little information on PRG3 expression and function have been available to date. Experiments carried out during the present study showed that PRG3 is N-glycosylated on asparagine 163 on the second extracellular loop. This N glycosylation has an influence on plasma membrane localisation and PRG3-induced filopodia formation. PRG3 is mainly expressed in the brain with the highest expression in late embryonic and early postnatal stages. Furthermore, the data suggests that PRG3 plays a role during neuronal development. In young immature neurons, PRG3 was localized in the plasma membrane of all neurites with the highest expression level in the neurite shaft. In mature neurons, PRG3 exhibits a mainly axonal expression pattern. Therefore, PRG3 could play a role in processes such as stabilisation, pathfinding and active consolidation of neurites. As a membrane protein, PRG3 could possibly activate intracellular signalling cascades after stimulation by extracellular signals. In contrast to PRG3, LPP1 and 1a have been characterized in detail concerning their biochemical function. Their expression and function in the central nervous system, however, remained unexplored. In this study, it could be shown that LPP1 and 1a exhibit an outgrowth-associated function in neuronal cell lines and that LPP1 and 1a were expressed in the brain. Knockdown experiments in utero showed that LPP1 and 1a influence radial migration of cortical neurons during embryonic development. Neurons with LPP1/1a knockdown showed a delayed migration out of the (sub)ventricular zone into the cortical plate. Moreover, LPP1/1a knockdown led to migration halting in the lower layers of the cortical plate while the radial glial network, neuronal identity of transfected cells, proliferation and cell cycle remained unchanged. Furthermore, LPP1/1a shRNA-transfected neurons were able to adapt morphologically to their environment. During cortex development, LPP1 and 1a are thought to regulate extra- and/or intracellular phospholipid levels and their associated signal transduction pathways. These findings contribute to the understanding of possible functions of PRG3, LPP1 and 1a during brain development and neuronal differentiation. Elucidation of these processes might help to understand further reasons for congenital malformations of the brain.