Experimentelle Untersuchung des MMP-Inhibitors Aktinonin ex vivo und in vivo am diffusen Lebermetastasenmodell der Ratte

Abstract

Nach heutigem Kenntnisstand spielen Matrixmetalloproteinasen eine entscheidende Rolle bei der hepatischen Metastasierung maligner Tumore. MMPs sind Enzyme, die für den Abbau der extrazellulären Matrix verantwortlich sind, und somit eine wichtige Rolle bei der Tumorprogression, -invasion und -metastasierung spielen. Beim kolorektalen Karzinom (des Menschen) ist eine erhöhte Expression von MMP-2 und -9 im Primärtumor mit einer vermehrten Lebermetastasierung assoziiert. Die proteolytische Aktivität dieser Enzyme lässt sich durch synthetische MMP-Inhibitoren hemmen. Diese MMP-Inhibitoren stellen somit ein potentielles onkologisches Therapieprinzip dar. In der vorliegenden Studie wurde der synthetische MMP-Inhibitor Aktinonin in seiner Wirksamkeit auf die Metastasierung von CC 531-Tumorzellen ex vivo (Matrigel Invasionsassay) und in vivo (diffuses Lebermetastasenmodell der Ratte) überprüft. Zur ex vivo Untersuchung des MMP-Inhibitors wurden Transwell-Filter mit Matrigel beschichtet und CC 531-Tumorzellen hinzugefügt. Anschliessend erfolgte die Zugabe von Aktinonin (in 10 %iger Ethanol-Saline-Lösung). Nach Inkubation, Fixierung und Färbung erfolgte die Auswertung durch das Auszählen der Zellen im Filter, welche durch das Matrigel diffundierten. Als Ergebnis in Bezug auf die Frage, ob der MMP-Inhibitor Aktinonin die Invasion von CC 531-Tumorzellen ex vivo verringert, zeigte sich, dass mit steigender Konzentration von Aktinonin die Zellzahl stetig abnahm, die durch das Gel diffundierte. Bei einer Endkonzentration von 100 µg Aktinonin / ml kamen noch 28,4 % der Gesamtzellzahl durch. Aktinonin senkte also die Tumorzellinvasion der CC 531-Zellen um 71,6 %. Zur in vivo Untersuchung des MMP-Inhibitors wurde das diffuse Lebermetastasenmodell der Ratte herangezogen. Hierbei wurden bei insgesamt 14 männlichen WAG-Ratten mittels Tumorzellsuspensionsverfahren hergestellte CC 531-Zellen portalvenös injiziert. Eine Gruppe (Behandlungsgruppe, bestehend aus 8 Tieren) wurde mit dem MMP-Inhibitor Aktinonin über 5 Tage intraperitoneal behandelt, die andere Gruppe (Kontrollgruppe, bestehend aus 6 Tieren) wurde lediglich mit der Vehikel- Lösung (NaCl, 0,9 %) über den gleichen Zeitraum intraperitoneal behandelt. 14 Tage nach der Tumorimplantation erfolgte die Auswertung anhand des Tumor replacement Modells sowie die Dokumentation des Lebergewichtes. In Bezug auf die zweite Fragestellung, ob der MMP-Inhibitor Aktinonin die Metastasierungsrate und/oder das Wachstum hepatischer Metastasen portalvenös implantierter CC 531-Zellen in vivo ebenfalls verringert, zeigte sich, dass der Anteil des Tumorgewebes am Lebergesamtvolumen im Mittel 6,88 % bei der Behandlungsgruppe und 52,50 % bei der Kontrollgruppe betrug. Ausserdem liess sich ein Unterschied im Lebergewicht zwischen beiden Gruppen feststellen. So betrug das relative Lebergewicht der Behandlungsgruppe im Mittel 4,12 % und das der Kontrollgruppe im Mittel 6,33 %. Anhand dieser Arbeit wurden in einem geeigneten in vivo Lebermetastasenmodell der Ratte die Vorzüge der Behandlung mit dem MMP-Inhibitor Aktinonin verdeutlicht. Die vorliegende Studie stellt somit einen vielversprechenden Ansatz dar, in Bezug auf einer potentiellen onkologischen Therapie maligner Lebermetastasen kolorektaler Karzinome mittels eines MMP-Inhibitors.

According to the contemporary knowledge, matrix metalloproteinases (MMPs) play a decisive role in the metastatic spread of malignant tumours to the liver. MMPs are enzymes, which are responsible for the degradation of the extracellular matrix and are therefore very important tools in tumourprogression, -invasion and metastatic spread. In the colorectal carcinoma (in humans) an increased expression of MMP -2 and -9 in the primary tumour is associated with an increased hepatic metastasis. Synthetic MMP- inhibitors are able to block the proteolytic activity of these enzymes. Consequently, MMP-inhibitors represent a potential therapeutic principle in oncology. In the present study the synthetic MMP-inhibitor actinonin was examined for his effectiveness on the metastatic spread of CC 531 tumour cells ex vivo (matrigel invasion assay) and in vivo (rat liver tumour model). For the ex vivo test transwell filters were coated with matrigel. The matrigel- coated filters were filled with CC 531 cells, after which actinonin was added (in 10% ethanol/saline). After incubation, fixation and staining, the analysis took place by counting the amount of cells which diffused through the matrigel. Refering to the question, if the MMP-inhibitor actinonin decreased the invasion of CC 531 tumour cells ex vivo it showed, that the number of invading cells decreased with increasing actinonin concentration and stagnated at 100 µg / ml with 28,4 %. This means, that actinonin decreased the tumour cell invasion of CC 531 cells by 71,6 %. To test the MMP-inhibitor in vivo the rat liver tumour model was used. WAG rats (n = 14) were injected with CC 531 cells via the intraportal vein. Group I (n = 8) was treated with actinonin, group II (n = 6) with a vehicle solution (NaCl, 0,9 %) for the duration of 5 days starting on the day of tumour implantation. Analysis took place 14 days after tumour implantation using the tumour replacement model as well as documenting the liver weight. Refering to the question, if the MMP-inhibitor actinonin decreased the metastatic rate and / or the growth of hepatic metastases of portal venous injected CC 531 cells in vivo, it showed an arithmetic mean of 6,88 % for group I and 52,50 % for group II for tumour tissue compared to the hole liver volume. Also noted was a difference in liver weight between the two groups, for group I 4,12 % and for group II 6,33 % as arithmetic mean. This study shows the advantages of the MMP-inhibitor actinonin using a suitable in vivo rat liver tumour model, therefore representing a promising potential oncological therapy of malignant hepatic metastases of colorectal carcinoma.